作为生命体的基本遗传物质,DNA大分子及其表观遗传修饰一直是生命科学领域的研究热点之一。其中,DNA磷硫酰化（Phosphorothioate,PT）修饰,即硫原子取代DNA骨架磷原子上的非桥联氧原子,是目前唯一已知的发生在DNA骨架上的天然修饰。PT修饰以Rp构象广泛存在于原核生物中,包括多种人类致病菌以及肠道微生物。目前,PT这一新型表观遗传修饰的生理学功能、作用机制、合成代谢等诸多科学问题尚未得到充分阐明。本研究针对PT修饰依赖的限制系统的作用机理,建立了一种DNA断裂损伤鉴定方法。发现DNA磷硫酰化修饰限制系统中PT修饰敲除表型较野生型和PT修饰限制双敲除菌株产生了50,000多个特征位点并发现腺苷酸（AA）之间的DNA断裂热点。为了阐明PT修饰对宿主菌在不同环境中的生理学影响,本研究开发了一种基于荧光蛋白标记的细菌竞争性共生长平台。研究发现:1)在氧化压力下,Na Cl O（Cl O-）处理的含PT修饰（PT+）菌株较修饰缺失突变株（PT-）对氧化胁迫有更高的敏感度;2)营养竞争压力下,PT+菌株前期处于生长弱势,然而该压力维持三天后PT+菌株获得了新的生长优势;3)温度胁迫压力下,大肠杆菌PT+菌株表现出对高温更强的耐受能力;4)小鼠肠道微生物竞争定植模型中,PT+菌株在定植和生长中均表现弱的生长活性,造成宿主鼠肠道溃烂并在器官间转移。为阐明PT修饰的动态过程以及丰度稳定的生理学意义,本研究还以最新发现的恶臭假单胞菌P.putida S1的PT修饰系统为基础描绘了S1菌株的基因组DNA PT修饰图谱。发现其具有部分修饰特征,其修饰保守序列为5’-Gps ATC-3’,占基因组总GATC的7.33%,呈DNA单链分布并主要发生在蛋白质编码区。另一方面,本研究还在S1菌株中引入了另外一种不同类型的PT修饰,实现了5’-Gps ATC-3’和5’-Gps GCC-3’双修饰系统的构建。研究发现,该双系统中,5’-Gps ATC-3’与5’-Gps GCC-3’的修饰位点数目比例为1:2.92;5’-Gps ATC-3’修饰位点较单修饰系统下降了59%;注释其PT修饰位点所处功能区域,发现95个CDS区的PT修饰丰度上调。本研究还对该双修饰系统进行转录组测序分析和生理学分析。差异表达基因中,双修饰系统中出现了251个基因的表达上调,主要为有机酸代谢、核苷酸或小分子结合相关基因;同时出现了398个基因表达下调,主要为细胞膜组成相关基因。在生理活性方面,S1双修饰系统对氧化剂表现出更高的敏感性,进一步证实基因组DNA上的PT修饰赋予了宿主菌氧化劣势,降低了基因组稳定性。综上,本研究以基因组DNA上的磷硫酰化修饰为研究对象:1)通过构建DNA损伤位点检测方法,明确了PT限制系统损伤热点及损伤频率;2)通过建立共培养系统,阐明了不同条件下PT修饰对于宿主菌的生理学意义;3)研究了PT修饰菌株在小鼠肠道中的定植能力和生长状态;4)鉴定了一株恶臭假单胞菌中PT修饰基因组图谱并描绘其分布特征;5)构建了DNA PT双修饰表达系统,并阐明了两种不同PT修饰在基因组上的分布特征以及相互作用;6)阐明了PT双修饰系统对宿主菌转录组的影响,揭示了PT修饰表观调控网络。本研究对PT修饰这一新型表观修饰的生理学功能、表观遗传调控机理、生物合成途径等进行了全面解析,加深了对PT修饰的理解和认知;建立的多个技术平台将为PT修饰的深入研究,尤其是对肠道微生物中广泛分布的PT修饰,奠定了技术基础并初步提供理论指导和科学依据。