立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)是一类十分重要的植物病原真菌,寄主范围广泛,可引起包括水稻、小麦、玉米等重要作物在内的多种作物菌核病的发生,危害十分严重。而关于水稻纹枯病致病病原菌菌核的形成和发育机理,目前国内外研究已经有较多报道,但主要集中于营养和环境因子等对菌核形成的影响,而在菌核形成的分子生物学研究方面,尽管有了一些有益的探索,但至今仍缺乏深入的研究。许多与立枯丝核菌菌核形成的相关基因有待进一步研究发现。本项目采用抑制消减杂交方法(Suppression Subtractive Hybridization,以下简称SSH)结合虚拟Northern筛选方法(virtual Northern)构建了水稻纹枯病菌菌核形成过程诱导表达产生的差减cDNA文库,分离并克隆出菌核形成相关基因,从基因转录表达水平探讨菌核形成机理,以期为水稻纹枯病防治提供理论基础。项目以GD-118菌株菌丝形成期材料mRNA为驱动子(driver),以菌核形成期mRNA为检测子(Tester),分别提取材料总RNA,分离mnRNA并反转录成cDNA,经Rsa-Ⅰ酶切,连接不同接头后进行连续两次消减杂交和两次PCR反应以获得差异表达基因片段。将PCR产物与T载体连接并转化DH5α大肠杆菌感受态细胞,通过蓝白斑筛选获得重组克隆,构建纹枯病原菌菌核特异性表达cDNA文库。从库中随机筛选145个白色菌落经PCR鉴定其中有112个克隆有目的基因片段插入,且插入片段大小主要分布在200-500bp之间。挑取阳性克隆进行测序,所得序列利用DNAMAN软件去除载体及接头序列,剔除重复序列,获得部分差异表达ESTs。对所获得的ESTs继续应用Virtual Northern杂交筛选,以菌丝、菌核cDNA序列为探针进行验证。将经过验证差异表达明显的序列做进一步同源性比对并分析相关序列的表达结果,获得了菌核形成相关的28条特异表达基因片段,其中有16条序列在GeneBank上较高同源性序列,主要涉及胁迫响应、转录调控、信号传导、合成代谢等,其中另有12条序列没有在NCBI上获得合适匹配的蛋白序列,可能为新发现的基因片段。这为进一步分析水稻纹枯病菌菌核形成过程的相关基因提供了科学线索。