复方扶芳藤合剂口服结合BMSCs配合FG移植对兔膝关节软骨组织形态学的影响

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目的:通过检测模型兔膝骨性关节炎(knee osteoarthritis,KOA)的软骨组织的病理改变,初步阐明复方扶芳藤合剂结合骨髓基质干细胞(rabbit bone mesenchymal stem cells,rBMSCs)复合纤维蛋白凝胶(fibrin glue,FG)移植治疗对骨性关节炎关节软骨的影响,并探讨其作用机理。  方法:1.采用全骨髓贴壁筛选法分离培养BMSCs。取第3代MSCs在地塞米松、左旋Vit C、β-磷酸甘油作用下向成骨细胞诱导分化;在地塞米松、IBMX、吲哚美辛的作用下向脂肪细胞诱导分化。观察细胞的形态变化情况,诱导14d后进行碱性磷酸酶检测和油红O染色以检测MSCs是否分化成骨和脂肪细胞。2.本实验将40只新西兰大白兔随机分为生理盐水灌胃组(A组),百年乐灌胃组(B组),注射BMSCs+FG复合物组(C组),百年乐灌胃+注射BMSCs+FG复合物组(D组),每组10膝。采用管型石膏固定膝关节的方式造模,造模6周后采用各组对应的方法处理或治疗,治疗结束一周后,空气栓塞处死试验兔,解剖膝关节,肉眼观察兔关节软骨表面情况;切取部分内侧胫骨平台软骨按照标本制备方法制定后,予HE染色、Mallory染色,进行光镜观察并摄像。  结果:1.原代分离培养的贴壁细胞呈长梭形,漩涡状排列,8~10d达90%以上融合;传代后增殖迅速,细胞为单一的梭形,排列更加有序。BMSCs经成骨诱导剂诱导后,碱性磷酸酶表达阳性;经脂肪诱导剂诱导后,油红O染色阳性。2.肉眼观察: A组关节面不光滑,无光泽,软骨不透明,有明显缺损和新生物,滑膜色暗充血肿胀。D组关节腔未见明显新生物,色泽较暗,软骨较光滑但透明差。光镜观察:A组关节软骨层变薄、粗糙,部分区域软骨细胞核固缩、坏死。浅表层软骨细胞消失,过渡层细胞外露,辐射层细胞增生呈簇状、染色质粗、不均匀,甚至软骨下骨囊性变。四层结构不易分辨。B、C组软骨表面欠光滑,裂隙少,裂隙周围细胞明显增多,软骨层轻度变薄,过渡层细胞和辐射层细胞轻度增生,染色质分布较均匀,四层结构基本清晰。D组软骨表面基本完整,软骨细胞数量增多,四层结构基本清晰,潮线结构基本完整。Mankin’S评分为A组7.60±0.69,B组5.50±0.61,C组5.80±0.81,D组5.00±0.67,B、C、D组与A组比较有差异(P<0.05),D组与B、C组比较无显著差异(P>0.05)。  结论:1.全骨髓贴壁筛选法分离培养 BMSCs,可有效分离和扩增BMSCs,分离培养的BMSCs生长稳定,增殖力强。2.利用复方扶芳藤合剂口服,配合可注射支架(FG)复合BMSCs局部治疗KOA,对KOA关节软骨剥脱有一定的修复作用,从而延缓KOA的病变发展。
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