Salusins是2003年从编码人类扭转应力障碍基因TOR2A进行选择性剪切的产物,包括28个氨基酸残基组成的salusin-α和20个氨基酸残基组成的salusin-β,salusin-a和salusin-β具有引起心动过缓和促血管平滑肌细胞有丝分裂作用。Salusin-a和salusin-β在动脉粥样硬化的发生发展中起重要作用,salusin-β促进人巨噬细胞的泡沫化,而salusin-α具有相反的作用。在人动脉粥样硬化斑块组织中的血管平滑肌细胞(Vascular smooth muscle cells,VSMCs)和成纤维细胞中主要表达salusin-β。本论文主要分为三个部分,分别探讨了(1)salusin-β在VSMCs增殖、分泌纤维化分子及高血压血管重构中的作用;(2)salusin-β在VSMCs迁移及血管损伤内膜增生中的作用;(3)salusin-β在VSMCs泡沫化及单核细胞粘附性的作用。研究结果发现salusin-β在促进VSMCs的增殖、分泌纤维化分子、迁移、泡沫化和单核细胞粘附中起重要作用,提示salusin-β是干预高血压、血管损伤、动脉粥样硬化等血管重构性疾病的重要靶点之一。一、Salusin-β促进血管平滑肌细胞增殖和分泌纤维化分子以及在高血压血管重构的作用1.背景VSMCs是血管壁结构的主要成分。VSMCs增殖和血管纤维化与很多临床疾病密切相关,包括高血压,动脉粥样硬化、糖尿病及其重要靶器官损害。长期的血压升高促进细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)在血管壁的合成与沉积,诱导血管硬化,加重高血压的发展,从而形成一个恶性循环。高血压血管病变主要表现为血管顺应性降低、僵硬度增加和动脉管壁增厚,而血管壁的增厚根本原因主要是VSMCs的增殖。高血压血管病变既是高血压的重要病理改变,又是高血压维持和发展的结构基础,因此逆转或抑制血管重构成为防治高血压及靶器官损害的重要策略之一。但salusin-β在高血压血管重构中是否发挥作用尚不明确,本研究主要探讨salusin-β在VSMCs增殖和分泌纤维化分子的作用及下游信号通路。2.目的本研究探讨了 salusin-β在人VSMCs增殖和纤维化中的作用及分子机制,并探讨了大鼠salusin-β过表达对血管重构和血压的影响。3.方法人的胸主动脉VSMCs培养在含体积分数为10%胎牛血清(FBS)的F12K Kaighn,s改良培养基中进行连续传代培养。CCK-8试剂盒(Cell counting kit-8 kits)检测salusin-β对VSMCs的增殖作用,EdU掺入实验检测salusin-β对VSMCs的DNA合成速率的作用,流式细胞仪检测VSMCs周期的分布。采用酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)测定 salusin-β 和环腺苷酸(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)水平,用蛋白质免疫分析技术(Western blotting)检测总的和磷酸化的细胞外信号调节激酶1/2(extracellular signal-regulated kinasl/2,ERK1/2),c-Jun 氨基端激酶(JNK),p38丝裂素活化蛋白激酶(p38),蛋白激酶A(ProteinkinaseA,PKA),cAMP反应元件结合蛋白(cAMP response element binding protein,CREB),表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)和信号蛋白 smad2/3 的水平,磷酸化的组蛋白H3(Phosphorylated histone H3,P-H3),磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase,GAPDH)。用 real-time PCR(RT-PCR)法检测Ⅰ型胶原(collagen-Ⅰ),Ⅲ 型胶原(collagen-Ⅲ),转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)和结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)的 mRNA 水平。大鼠尾静脉注射慢病毒载体编码salusin-β过表达基因,采用Powerlab尾动脉测压系统测量清醒状态下大鼠的尾动脉收缩压(systolic arterial pressure,SBP),Masson 染色(Masson’s trichrome staining)检测主动脉、肾动脉和肠系膜动脉的血管重构情况。4.结果(1)Salusin-β剂量依赖性地促进VSMCs的增殖,在浓度为10nM、时间为48h时salusin-β的促增殖效应最明显。Salusin-β减少GO/G1期的VSMCs的分布,增加S期的VSMCs和EdU阳性细胞数。(2)Salusin-β升高VSMCs的cAMP水平,并促进PKA的磷酸化,salusin-β的促VSMCs增殖效应被腺苷酸环化酶抑制剂SQ22536预处理所抑制;Salusin-β促进ERK1/2的磷酸化,30min时ERK1/2的磷酸化水平最高,该效应被腺苷酸环化酶抑制剂SQ22536、PKA抑制剂Rp-cAMP和EGFR酪氨酸激酶抑制剂AG1487所阻断;salusin-β增加VSMCs的EGFR和CREB磷酸化水平,腺苷酸环化酶抑制剂SQ22536、PKA抑制剂Rp-cAMP和EGFR酪氨酸激酶抑制剂AG1487抑制salusin-β诱导的CREB的磷酸化;腺苷酸环化酶抑制剂SQ22536、PKA抑制剂Rp-cAMP预处理能降低salusin-β诱导的EGFR的磷酸化;腺苷酸环化酶抑制剂SQ22536、PKA抑制剂Rp-cAMP、EGFR酪氨酸激酶抑制剂AG1487、ERK抑制剂U0126、CREB抑制剂KG501预处理阻断Salusin-β引起的VSMCs增殖效应。(3)Salusin-β 刺激 VSMCs 的 collagen-Ⅰ、collagen-Ⅲ、TGF-β1 和 CTGF 的 mRNA水平的升高,抗salusin-β抗体阻断salusin-β的促血管平滑肌细胞分泌纤维化分子效应。(4)Salusin-β促进VSMCs的smad2/3的磷酸化,激活素受体样激酶5(Activin receptor-like kinase 5,ALK5)抑制剂 A83-01 预处理阻断 Salusin-β 诱导的collagen-Ⅰ、collagen-Ⅲ 和 CTGF 的 mRNA 水平的升高和 smad2/3 的磷酸化。(5)Salusin-β过表达大鼠的血浆、主动脉、肾动脉和肠系膜动脉的salusin-β水平显著增加,salusin-β过表达大鼠的主动脉、肾动脉和肠系膜动脉的中膜厚度、中膜厚度与内径比值显著升高,此外,salusin-β过表达大鼠的肾动脉和肠系膜动脉的内径也明显减少,Masson染色显示salusin-β过表达大鼠的血管外膜的厚度和胶原沉积也显著增加。(6)Salusin-β过表达增加主动脉、肾动脉和肠系膜动脉中膜组织的EGFR、ERK1/2和CREB的磷酸化,但对JNK和p38无显著作用;salusin-β过表达显著增加主动脉、肾动脉和肠系膜动脉组织的增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)和P-H3等细胞增殖标志物,此外salusin-β过表达大鼠的主动脉、肾动脉和肠系膜动脉也表现出collagen-Ⅰ、collagen-Ⅲ、TGF-β1和CTGF的mRNA水平的升高和smad2/3的磷酸化。(7)Salusin-β过表达引起剧烈和持久的血压升高和心动过速;salusin-(3过表达3天,大鼠的尾动脉收缩压开始升高,2周达到顶峰,一直持续到4周以上,过表达2周后心率也开始升高;麻醉情况下的平均动脉血压(mean arterial pressure,MAP)和心率(heart rate,HR)进一步证实了salusin-β诱导的高血压和心动过速效应。5.结论Salusin-β 通过 cAMP-PKA-EGFR-CREB/ERK 信号通路促进人 VSMCs 的增殖,通过TGF-β1-smad信号通路促进人VSMCs分泌纤维化分子,大鼠salusin-β过表达引起高血压和血管重构。二、Salusin-β通过ROS/NFκB/MMP-9促进血管平滑肌细胞的迁移和血管损伤后的内膜增生1.背景在生理情况下,VSMCs的增殖和凋亡处于动态平衡,而在病理情况下VSMCs会发生表型转换,进而启动增殖和迁移程序,在动脉粥样硬化和经皮冠脉介入术术后再狭窄等心血管疾病的发病中起关键作用。VSMCs由中膜迁移至内膜引起的内膜增生是动脉粥样硬化和冠状动脉成形术后再狭窄的主要原因,过去研究发现血小板衍生生长因子(Platelet derived growth factor,PDGF)、表皮生长因子(Epidermal growth factor,EGF)、成纤维细胞生长因子(Fibroblast growth factor,FGF)和血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)等因素促进VSMCs的增殖和迁移,导致内膜新生和增厚,导致血管再狭窄。因此寻找引起VSMCs增殖和迁移的重要靶分子成为治疗动脉粥样硬化和经皮冠脉介入术术后再狭窄等心血管疾病的重要策略之一。Salusin-β是否在VSMCs迁移及血管损伤引起的内膜增生中发挥作用还不清楚。2.目的本研究探讨了 salusin-β在VSMCs迁移中的作用及分子机制,并探讨了大鼠尾静脉注射腺病毒载体编码salusin-β的shRNA对血管损伤引起的内膜增生的影响。3.方法酶消化法分离大鼠胸主动脉原代平滑肌细胞,采用8周的SD大鼠,单侧颈动脉结扎法造成颈动脉损伤,苏木素-伊红染色(HE染色)对颈动脉进行病理检测,免疫组化和免疫荧光检测颈动脉salusin-β的表达,RT-PCR检测待测样品的MMP-9、MMP-2和salusin-β的mRNA水平,Western blot方法检测待测样品还原型烟酰胺腺嘌吟二核苷酸磷酸氧化酶2(Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase2,NOX2)、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4(Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase4,NOX4)、p65、IκBα、phosphor-IκBα、LaminB1、GAPDH、MMP-2 和 MMP-9 的蛋白表达,利用酶联免疫吸附测定法(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测待测样品的salusin-β水平,transwell和伤口愈合实验检测VSMCs的迁移效应,脂质体(Lipofectamine 2000)转染 siRNA,染色质免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation,ChIP)技术检测NFκB在基质金属蛋白酶-9(MMP-9)启动子的结合情况,Dihydroethidium(DHE)和 2’,7’-dichlorodihydrofluorescein diacetate(DCF-DA)作为超氧化物阴离子和过氧化氢荧光探针用来检测活性氧变化。4.结果(1)结扎4周后的颈动脉呈现轻度的内膜增生,8周以后内膜增厚更加明显;免疫组化和免疫荧光结果显示正常颈动脉的salusin-β表达较低,且主要位于血管外膜,而损伤后的颈动脉上的salusin-β表达主要位于新生内膜区域,损伤的颈动脉salusin-β的mRNA水平也明显增加。(2)划痕实验和Boyden小室趋化试验结果显示salusin-β剂量依赖性地促进VSMCs迁移的数目和距离,当salusin-β浓度为10 nM时效应最强。(3)Salusin-β剂量和时间依赖性促进VSMCs的MMP-9蛋白和mRNA的表达,但对MMP-2的蛋白和mRNA水平无影响;此外salusin-β增强MMP-9启动子的活性,抑制MMP-9能够阻断salusin-β引起的VSMCs迁移效应。(4)Salusin-β促进VSMCs的IκBα的磷酸化和降解,细胞浆的P65-NFκB表达下降,而细胞核的p65-NFκB表达明显增加。(5)Salusin-β增加NFκB在MMP-9启动子上的结合,抑制或下调NFκB减弱salusin-β引起的MMP-9的表达和VSMCs的迁移。(6)Salusin-β处理VSMCs上调NAD(P)H氧化酶2(NOX2)的蛋白表达,但对NOX4的蛋白水平影响不大,抑制NOX2可显著降低salusin-β诱导的VSMCs活性氧的产生;NOX2-siRNA抑制salusin-β引起的MMP-9蛋白的水平升高和p65的核移位;应用活性氧清除剂或NAD(P)H氧化酶抑制剂apocynin也能阻断salusin-β引起的MMP-9蛋白的增加、P65-NFκB的核移位和VSMCs的迁移效应。(7)尾静脉注射腺病毒介导的salusin-β shRNA可有效降低血管损伤引起的内膜增厚、内膜与中膜的比值、MMP-9和NOX2的蛋白水平增加、活性氧增多等病理改变。5.结论Salusin-β促进大鼠VSMCs的迁移和血管损伤引起的内膜增生,NOX2来源的活性氧是salusin-β引起P65-NFκB核移位的重要因素,进而正向调控MMP-9的活性和蛋白表达,引起VSMCs的迁移。salusin-β下调降低血管损伤引起的NOX2蛋白水平升高、活性氧产生及内膜增厚,干预salusin-β可能成为治疗动脉粥样硬化和支架内血管再狭窄等心血管疾病的重要策略之一。三、Salusin-β通过miR155/NOX2/NFKB促进人血管平滑肌细胞的泡沫化和单核细胞粘附1.背景VSMCs是泡沫细胞形成过程中必不可少的成分,泡沫细胞的形成是动脉粥样硬化的标志,也是动脉粥样硬化斑块破裂的危险因素。过去认为巨噬细胞是泡沫细胞的主要来源,但近年来发现VSMCs也是泡沫细胞形成的主要成分。血液中的淋巴细胞细胞募集到血管也是动脉粥样硬化发病过程中重要事件,是治疗动脉粥样硬化的潜在靶标之一。关于salusin-β在VSMCs泡沫化和单核细胞粘附性的作用并不清楚。2.目的本研究探讨了 salusin-β在VSMCs泡沫化的作用及分子机制,并探讨了salusin-β对VSMCs单核细胞粘附的作用及信号通路。3.方法人的胸主动脉VSMCs培养在含体积分数为10%胎牛血清(FBS)的F12K Kaighn’s改良培养基中进行连续传代培养。油红O染色和酶法检测VSMCs脂质沉积和胆固醇的水平,脂质体(Lipofectamine 2000)转染siRNA,Western blot方法检测待测样品 NOX2、p65、ACAT-1、VCAM-1、LaminB1 和 GAPDH 的蛋白表达,RT-PCR检测待测样品的ACAT-1、VCAM-1和miR155的mRNA水平,染色质免疫沉淀(Chromatin Immunoprecipitation,ChIP)技术检测 NFκB 在ACAT-1和VCAM-1启动子的结合情况,Dihydroethidium(DHE)作为超氧化物阴离子荧光探针用来检测细胞的活性氧变化。4.结果(1)Salusin-β剂量依赖性和时间依赖性促进脂滴在VSMCs的积聚和单核细胞的粘附,当salusin-β浓度为30 nM处理48h时效应最大。(2)Salusin-β升高VSMCs的ACAT-1和VCAM-1的荧光素酶报告基因活性、蛋白和mRNA水平。下调ACAT-1阻断salusin-β诱导的VSMCs脂质沉积和细胞内总胆固醇含量升高,减少VCAM-1抑制salusin-β诱导的VSMCs的单核细胞粘附。(3)Salusin-β处理VSMCs剂量依赖性地促进P65-NFκB的核移位,增加NFκB与ACAT-1和VCAM-1启动子的结合,NFκB抑制剂Bayll-7082消除salusin-β引起的ACAT-1和VCAM-1蛋白上调、VSMCs泡沫化和单核细胞粘附。(4)Salusin-β剂量和时间依赖性增加NOX2的表达和活性氧的产生,活性氧清除剂NAC、NAD(P)H氧化酶抑制剂apocynin或下调NOX2均阻断salusin-β引起的ACAT-1和VCAM-1蛋白上调、VSMCs泡沫化和单核细胞粘附。(5)Salusin-β时间依赖性促进VSMCs的miRl55的表达,下调miRl55降低salusin-β引起的NOX2、ACAT-l和VCAM-1蛋白上调、活性氧的产生、p65-NFκB的核移位、VSMCs的泡沫化和单核细胞粘附性。5.结论Salusin-β上调人VSMCs的miR155的表达,引起NOX2来源的活性氧生成增多和P65-NFκB的核移位,NFκB激活促进ACAT-1和VCAM-1的蛋白表达,引起VSMCs泡沫化和单核细胞粘附,干预salusin-β可能成为治疗动脉粥样硬化血管病变的重要策略之一。