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目的:运动性疲劳骨骼肌损伤会引起肌肉功能的失调与肌肉表现的下降,会伴随着机体运动范围的减小,肌肉出现肿胀、炎症反应,肌肉酸痛感增加等生理生化反应,同时增加了肌肉生长抑制素（myostatin,MSTN）的表达。而MSTN一直都是受关注的肌肉生长调节因子之一,其功能及表达量的变化可调节靶基因的表达,以改变肌肉的纤维组成及肌肉质量。低强度脉冲超声（low-intensity pulsed ultrasound,LIPUS）主要利用其非热效应发挥生物效应,它作用于肌肉组织可引起一系列的生物学反应。目前超声对肌肉损伤大多仅限于观察诊断,对不同声强的LIPUS照射改善肌肉损伤的效果也少有研究,但是否MSTN参与了 LIPUS对运动性疲劳肌损伤的改善仍需要探究。因此,本论文拟通过构建疲劳模型并进行LIPUS干预来探究其对骨骼肌损伤的预防效果及分子机制,从而为运动员提供一种便捷高效的预防肌肉损伤的物理手段,进而提高运动成绩。方法:动物实验:本研究以80只雌性成年Sprague-Dawley（SD）大鼠（体重200±20 g）为研究对象,随机分成8组:正常对照组（NC组）,疲劳模型对照组（EFC组）,30mW/cm2声强安静组（LIPUS30-Sed 组）,80 mW/cm2 声强安静组（LIPUS80-Sed组）,30/80mW/cm2轮替声强安静组（LIPUS30/80-Sed 组）,30mW/cm2声强疲劳组（LIPUS30-EF 组）,80 mW/cm2声强疲劳组（LIPUS30-EF 组）,30/80 mW/cm2轮替声强疲劳组（LIPUS30/80-EF组）,每组均为10只大鼠。超声组采用中心频率1 MHz,脉冲频率为1 KHz,占空比20%,不同声强进行照射,照射部位为股四头肌前侧中部,20min/d,共照射12w。疲劳组采用速度24m/min,40min/d的跑台运动,共12 w。12 w后处死并进行相关检测及形态学观察。Western Blot技术及PCR技术分析各组联合机制,即肌肉组织内MSTN介导的信号通路蛋白表达和microRNA信号通路传导的基因表达情况。细胞实验:以成肌细胞C2C12作为研究对象,分别以1%浓度的野生型小鼠血清培养基和MSTN基因敲除小鼠血清培养基培养细胞。将细胞复苏后接种于6孔板,分别设置野生对照组（WT组）,30 mW/cm2声强野生组（LIPUS30-WT组）,80 mW/cm2声强野生组（LIPUS80-Sed组）和MSTN基因敲除组（KO组）,30 mW/cm2 声强敲除组（LIPUS30-KO 组）,80 mW/cm2 声强敲除组（LIPUS30-KO组）,每组3个复孔并进行LIPUS干预。时长为20 min/d,强度为中心频率1 MHz、占空比20%、声强分别为30 mW/cm2和80mW/cm2。7d后进行细胞增殖检测（CCK-8试剂盒）,免疫荧光染色（核、线粒体、微丝）及相关蛋白检测。结果:1.大鼠生理指标结果:12 w大强度运动后,与NC组相比,EFC组大鼠体重显著降低（P＜0.05）、股四头肌重量极显著降低（P＜0.01）,抓力显著升高（P＜0.05）。运动后超声组及单纯超声组体重显著降低（P＜0.01,P＜0.05）,LIPUS80-EF组、LIPUS80-Sed 组及 LIPUS30/80-Sed 组股四显著降低（P＜0.05,P＜0.05,P＜0.01）。LIPUS30-EF组和LIPUS80-EF组抓力极显著升高（P＜0.01）;与EFC组相比,运动后超声组及单纯超声组体重均升高但不具有显著性。LIPUS30-EF组、LIPUS80-EF组及LIPUS30-Sed组股四头肌重量极显著升高（P＜0.01）,LIPUS30-Sed组及LIPUS30/80-Sed组抓力显著降低（P＜0.05）。120 Hz活体肌张力及50 Hz离体肌张力结果显示,与NC组相比,EFC组活体肌张力显著降低,离体肌张力降低但不具有显著性。LIPUS30-EF组及LIPUS30-Sed组活体肌张力极显著升高（P＜0.01）,LIPUS30/80-Sed组离体肌张力显著升高（P＜0.05）;与EFC组相比,LIPUS30-EF 组、LIPUS30/80-EF 组、LIPUS30-Sed 组、LIPUS80-Sed 组及LIPUS30/80-Sed 组活体肌张力极显著升高（P＜0.01）。LIPUS30-Sed 组、LIPUS80-Sed组及LIPUS30/80-Sed组离体肌张力极显著增高（P＜0.01）。2.大鼠生化指标结果:12w大强度运动后,与NC组相比,EFC组大鼠的血清CK含量、GDH含量、CRE含量及BU含量显著升高（P＜0.01,P＜0.01,P＜0.05,P＜0.01）,LDH含量升高但不具有显著性。LIPUS80-EF组及LIPUS30/80-EF组LDH 含量极显著升高（P＜0.01）,LIPUS80-Sed 组及 LIPUS30/80-Sed 组 CRE 含量极显著升高（P＜0.01）。LIPUS80-EF 组、LIPUS30-Sed 组及 LIPUS80-Sed 组 BU含量极显著升高（P＜0.01）;与EFC组相比,LIPUS30-EF组、LIPUS80-EF组、LIPUS30/80-EF 组、LIPUS30-Sed 组、LIPUS80-Sed 组及 LIPUS30/80-Sed 组 CK 均显著降低（P＜0.01,P＜0.01,P＜0.01,P＜0.05,P＜0.01,P＜0.01）。LIPUS80-EF组及 LIPUS30/80-EF 组 LDH 含量极显著升高（P＜0.01）,LIPUS30-Sed 组 LDH含量显著降低（P＜0.05）。LIPUS30-EF 组、LIPUS30/80-EF 组、LIPUS30-Sed 组、LIPUS80-Sed 组及 LIPUS30/80-Sed 组 GDH 含量显著降低（P＜0.05,P＜0.05,P＜0.01,P＜0.01,P＜0.01）。LIPUS30-EF 组、LIPUS80-EF 组、LIPUS30/80-EF 组、LIPUS30-Sed组 CRE 含量显著降低（P＜0.05）,LIPUS80-Sed 组及 LIPUS30/80-Sed 组 CRE 含量显著升高（P＜0.05）。LIPUS30-EF组及LIPUS80-EF组BU含量显著降低（P＜0.01）。3.股四头肌形态学结果:12w大强度运动后,HE染色结果显示:与NC组相比,EFC 组、LIPUS30-EF 组、LIPUS80-EF 组、LIPUS30/80-EF 组、LIPUS80-Sed组及LIPUS30/80-Sed组肌纤维平均面积均极显著减少（P＜0.01）,LIPUS30-Sed组极显著上升（P＜0.01）;与EFC组相比,其余组肌纤维平均面积均极显著增加（P＜0.01）。层黏连蛋白染色结果显示:与NC组相比,EFC组、LIPUS30-EF组、LIPUS80-EF组、LIPUS30/80-EF组及LIPUS80-Sed组肌纤维平均横截面积均极显著降低（P＜0.01）;与 EFC 组相比,LIPUS30-EF 组、LIPUS30-Sed 组 LIPUS80-Sed 组及LIPUS30/80-Sed组肌纤维平均面积均显著增加（P＜0.01）。电镜结果显示:与NC组相比,EFC组肌纤维排列混乱,间隙大线粒体数目增多且大小不一,部分发生融合,出现空泡,Z线消失;LIPUS30-EF组、LIPUS80-EF组及LIPUS30/80-EF组肌纤维排列混乱,线粒体数目增多,Z线不连续甚至模糊,出现空泡,部分线粒体有分裂趋势;LIPUS30-Sed组、LIPUS80-Sed组及LIPUS30/80-Sed组肌纤维排列整齐,线粒体分布在Z线周围,有融合趋势。micro-CT扫描血管化结果显示:与NC组相比,EFC组Tv及BvN显著降低（P＜0.01）,BvTh 极显著升高（P＜0.01）。LIPUS30-EF 组、LIPUS80-EF 组、LIPUS30/80-EF 组、LIPUS30-Sed 组、LIPUS80-Sed 组及 LIPUS30/80-Sed 组 Tv 显著降低（P＜0.01,P＜0.01,P＜0.01,P＜0.05,P＜0.01,P＜0.01）。LIPUS30-EF 组、LIPUS30/80-EF 组及 LIPUS30-Sed 组 BvN 显著升高（P＜0.05,P＜0.05,P＜0.01）。LIPUS30-EF 组、LIPUS80-EF 组及 LIPUS30/80-EF 组 BvTh 极显著降低（P＜0.01）,LIPUS30-Sed 组 BvTh 极显著升高（P＜0.01）;与 EFC 组相比,LIPUS30-EF 组、LIPUS30-Sed 组、LIPUS80-Sed 组及 LIPUS30/80-Sed 组 Tv 升高但不具有显著性,LIPUS80-EF组及LIPUS30/80-EF组降低但不具有显著性。LIPUS80-EF组及LIPUS30/80-Sed 组显著降低（P＜0.05）。LIPUS30-Sed 组、LIPUS80-Sed 组及LIPUS30/80-Sed 组 BvN 极显著升高（P＜0.01）。4.MSTN及其受体介导的Akt下游信号分子及线粒体相关蛋白表达结果:12 w大强度运动后,与NC组相比,EFC组及运动后超声组大鼠股四头肌MSTN、ActRIIB、DRP1的蛋白及其mRNA表达均极显著上升（P＜0.01）,Akt、mTOR、PGC-1α、MFN2蛋白和VEGF蛋白及其mRNA表达均极显著降低（P＜0.01）。AMPK降低但不具有显著性。LIPUS30-EF 组、LIPUS80-EF 组、LIPUS30/80-EF 组、LIPUS80-Sed 组及 LIPUS30/80-Sed 组 MSTN 蛋白表达极显著上升,LIPUS80-EF组mRNA表达显著升高。LIPUS80-EF组及LIPUS30/80-EF组ActRIIB蛋白表达量显著升高,LIPUS30/80-EF 组 mRNA 表达显著升高。LIPUS80-EF 组及 LIPUS80-Sed组DRP1蛋白表达显著上升,LIPUS30-EF组降低,LIPUS80-EF组mRNA表达升高。LIPUS30-EF 组、LIPUS80-EF 组、LIPUS30/80-EF 组、LIPUS30-Sed 组及LIPUS30/80-Sed 组 Akt 蛋白表达量显著降低,LIPUS80-EF 组、LIPUS30/80-EF 组及 LIPUS30/80-Sed 组 mRNA 表达极显著降低。LIPUS30-EF 组、LIPUS80-EF 组、LIPUS30/80-EF 组、LIPUS80-Sed 组及 LIPUS30/80-Sed 组 mTOR 蛋白和 mRNA 表达量极显著降低。LIPUS30-EF 组、LIPUS80-EF 组、LIPUS30/80-EF 组及LIPUS80-Sed 组 AMPK 蛋白表达量显著降低。LIPUS30-EF 组、LIPUS80-EF 组、LIPUS30/80-EF组及LIPUS30/80-Sed组PGC-1α蛋白表达量极显著降低,LIPUS80-Sed 组极显著降低。LIPUS30-EF 组、LIPUS80-EF 组、LIPUS30/80-EF 组、LIPUS80-Sed 组及 LIPUS30/80-Sed 组 MFN2 蛋白表达量极显著降低,LIPUS30-Sed组极显著升高。LIPUS30-EF 组、LIPUS80-EF 组及 LIPUS30/80-EF 组 mRNA 表达显著降低。EFC 组、LIPUS30-EF 组、LIPUS80-EF 组、LIPUS30/80-EF 组、LIPUS30-Sed组及LIPUS80-Sed组VEGF蛋白表达量极显著降低;与 EFC 组相比,LIPUS30-EF 组、LIPUS80-EF 组、LIPUS30/80-EF 组、LIPUS30-Sed 组、LIPUS80-Sed 组及 LIPUS30/80-Sed 组 MSTN、ActRIIB 及 DRP1蛋白表达量极显著降低,LIPUS30/80-EF 组、LIPUS30-Scd 组及 LIPUS30/80-Scd组 MSTN mRNA 表达极显著降低,LIPUS30-EF 组、LIPUS80-EF 组、LIPUS30-Sed组及LIPUS30/80-Sed 组 ActRIIB mRNA 表达极显著降低,LIPUS30/80-EF 组、LIPUS30-Sed 组、LIPUS80-Sed 组及 LIPUS30/80-Sed 组 DRP1 mRNA 表达显著降低。LIPUS30-EF组、LIPUS30-Sed组及LIPUS80-Sed组Akt蛋白表达量极显著升高,LIPUS30/80-EF 组表达量极显著降低。LIPUS30-Sed 组及 LIPUS80-Sed 组 mRNA表达显著升高,LIPUS30/80-EF组及LIPUS30/80-Sed组mRNA表达显著降低。LIPUS80-EF 组、LIPUS30/80-EF 组、LIPUS80-Sed 组及 LIPUS30/80-Sed 组 mTOR蛋白表达量显著降低,LIPUS30-Sed组mTOR蛋白及mRNA表达显著升高。LIPUS30-EF组、LIPUS80-EF组及LIPUS30/80-EF组AMPK蛋白表达量显著降低。LIPUS80-EF组PGC-1α蛋白表达量显著降低、LIPUS30-Sed组及LIPUS80-Sed组PGC-1α蛋白表达量显著升高。LIPUS30-EF 组、LIPUS30/80-EF 组、LIPUS30-Sed组、LIPUS80-Sed组及LIPUS30/80-Sed组MFN2蛋白表达量显著升高,LIPUS30/80-Sed 组 mRNA 表达显著升高。LIPUS30-EF 组、LIPUS30/80-EF 组、LIPUS80-Sed组及LIPUS30/80-Sed组VEGF蛋白表达量显著升高。30 mW/cm2声强的LIPUS干预方式对MSTN、ActRIIB、DRP1蛋白表达的结果优于80 mW/cm2声强及两者联合的干预方式。5.股四头肌microRNA的表达结果:12 w大强度运动后,与NC组相比,LIPUS30-EF 组 miR-106b-5p 表达极显著升高（P＜0.01）,EFC 组 miR-500-5p、miR-27a-3p、miR-136b-5p 表达显著升高（P＜0.01、P＜0.01、P＜0.05）,LIPUS30-Sed组miR-136b-5p极显著升高（P＜0.01）,EFC组miR-486表达降低但不具有显著性;与EFC组相比,LIPUS30-Sed组miR-106b-5p表达极显著降低（P＜0.01）,LIPUS30-EF 组、LIPUS80-EF 组、LIPUS80-Sed 组及 LIPUS30/80-Sed 组 miR-500-5p显著降低（P＜0.05）,LIPUS30-EF 组、LIPUS80-EF 组及 LIPUS30/80-EF 组 miR-486升高但不具有显著性。LIPUS80-EF组、LIPUS30/80-EF组、LIPUS30-Sed组及LIPUS80-Sed 组 miR-27a-3p 表达显著降低（P＜0.05、P＜0.01、P＜0.01、P＜0.01）。6.LIPUS对Myostatin敲除鼠血清干预的成肌细胞的影响结果:30 mW/cm2声强的LIPUS可促进成肌细胞的线粒体数量和密度,其细胞核数量也增加,微丝在该声强LIPUS刺激后更紧密。结论:1.运动性疲劳会造成大鼠骨骼肌损伤,30 mW/cm2 LIPUS可以预防疲劳大鼠的肌肉流失、体重下降及肌张力降低,改善肌肉血管的相关性能。2.LIPUS干预对股四头肌损伤有改善作用,其机制可能通过抑制MSTN表达,介导Akt下游mTOR途径促进蛋白质合成从而缓解股四头肌损伤;同时可能通过促进AMPK/PGC-1 α表达,激活线粒体融合蛋白MFN2的表达、抑制分裂蛋白DRP1的表达。从不同声强干预方式来看,30 mW/cm2声强的预防效果要优于80 mW/cm2声强及两者联合的治疗效果。3.30 mW/cm2声强LIPUS可以促进成肌细胞增殖并对成肌细胞核、线粒体、微丝等细胞微结构具有调控效应,从体外实验进一步解释LIPUS改善骨骼肌功能的细胞机制。