甲型肝炎病毒（HAV）是一种无包膜单链RNA病毒,是人类急性肝炎的重要病因之一,HAV主要通过粪-口途径（如接触HAV污染的食物、水、以及日常生活接触）传播,偶尔可通过输血及血制品传播。人对HAV普遍易感,随着经济、卫生条件的改善和甲肝疫苗的应用,甲型肝炎的发病率随之降低,但这也一定程度上导致未免疫人群抗体水平下降,易感性升高,更易引起甲肝的暴发。HAV在环境中较稳定,对干燥、高温、高或低pH值、光和紫外线暴露等抵抗力较强,大多数食源性病毒的传染性剂量很低,能在食品表面长时间存活并保持传染性,食品中所含PCR抑制剂较高,影响检出率,因此需要敏感特异的方法来评估食品安全。本研究比较和优化了不同牡蛎前处理方法、四种实时荧光定量 Real-time RT-PCR（RT-qPCR）和微滴芯片数字 PCR（RT-ddPCR）,三种 HAV RNA提取试剂盒,以便为食品基质中HAV检测提供一种合适、灵敏的方法。第一部分牡蛎不同前处理方法的比较向牡蛎中加入HAV减毒活疫苗作为人工染毒模拟贝类样本,将牡蛎分别用蛋白酶K处理法（方法1）、蛋白酶K+PEG沉淀法（方法2）、蛋白酶K+PEG沉淀+氯仿抽提法（方法3）、以及国内标准GB/T22287-2008中贝类前处理法（方法4）进行处理,采用SPSS25.0对数据进行统计分析。首先用方法1、2、3对提取后的HAV Ct值、回收量、回收率进行统计分析,结果表明几种前处理方法的差异具有统计学意义（Ct值比较P=0.027<0.05;回收量比较P=0.002<0.05;回收率比较P=0.002<0.05）,选用Bonferroni法对数据进行两两比较得出,方法2得到的Ct值小于方法1、3,回收量、回收率均高于方法1、3,方法2回收率为6.7%±0.8%。对3种方法处理后提取的RNA分别经过10倍稀释后检测,10倍稀释标本Ct值均高于未稀释标本Ct值,10倍稀释液/原液的回收率之比分别为0.84、1.03、1.08,方法2、3提取的RNA10倍稀释后回收率高于未稀释标本的回收率,说明牡蛎消化腺组织中抑制剂对PCR反应和回收率产生一定抑制作用,但抑制效果不明显。选取上述回收效果最好的方法2与国标方法4进行比较。首先分别对不同浓度HAV人工定量混合的牡蛎进行前处理,将回收得到的Ct值以及病毒回收量、回收率进行统计分析,结果显示,添加病毒量越大,Ct值越低,病毒回收量和回收率越高,方法2HAV回收率为3.8%～6.4%（P=0.000<0.001）,方法4HAV回收率为1.0%～11.8%（P=0.026<0.05）,差异均具有统计学意义。方法2和方法4相同浓度水平上回收率的比较中,高浓度污染时,差异无统计学意义（P=0.063>0.05）,中、低浓度污染时,方法2的病毒回收率高于方法4,各自差异均具有统计学意义（P<0.001）,HAV中、低浓度污染时,选用方法2,回收效果较好。采用方法2（蛋白酶K+PEG沉淀法）对60份市售牡蛎进行检测,均未检出阳性结果。综上,方法2即蛋白酶K+PEG沉淀法用于检测牡蛎中HAV效果最好。在HAV污染量低时,选用方法2回收得到病毒量和回收率较高,今后可加大不同季节的标本检测数量,并进一步探索更敏感特异的牡蛎前处理方法,以及核酸检测方法。第二部分甲型肝炎病毒核酸检测及RNA提取方法的比较比较了 HAV四种核酸检测方法,分别是实时荧光定量Real-time RT-PCR（RT-qPCR）（A、B、C方法）及微滴芯片数字RT-PCR（RT-ddPCR）（D方法）。其中,优化后的A、B方法对质粒标准品均可检测至10copies/μl;用A、B、C方法对梯度稀释的HAV疫苗株进行检测,A、B、C方法标准曲线的斜率、R2值、扩增效率（-3.446～-3.297、0.991～0.998、95.07%～101.051%）均在常规可接受范围（-3.6～-3.0、>0.99、90%～110%）内,其中C方法扩增效率略高;对其它病毒核酸进行检测,特异性良好;用A、B、C方法对40份人工污染HAV牡蛎、市售牡蛎及血清标本、HAV疫苗标本进行检测,A、B、C方法的阳性检出率分别是50%、47.5%、55%,经过卡方检验差异无统计学意义（P=0.792>0.05）。对D方法进行检测条件的优化,最终确定引物探针浓度为1 μm、1 μm、0.25 μm,退火温度定为55℃,其检测范围在4.6copies/μl～7.5 × 104copies/μl之间;特异度检测时,诺如病毒和柯萨奇病毒A组有2～3个阳性微滴,因此当阳性微滴>3个时可判定为阳性结果;A方法与D方法对梯度稀释的HAV减毒活疫苗检测中,灵敏度没有明显差异;比较A、D方法对中、低浓度HAV人工污染牡蛎的回收率,中浓度A、D方法回收率差别不大（P=0.879>0.05）,分别为3.16%±0.08%、3.15%±0.07%;低浓度回收率分别为 2.65%±0.49%、2.84%±0.01%（P=0.642>0.05）),D方法略高于A方法,但差异均无统计学意义。四种核酸检测方法（A、B、C、D方法）对26份市售牡蛎进行检测,均未检出阳性结果。选用 Qiagen52906、Omega R6874-01 和 Roche 11858882001 三种核酸提取试剂盒对人工HAV定量混合的牡蛎标本中HAV RNA进行提取,提取效率Roche试剂盒高于Qiagen试剂盒、Omega试剂盒,Ct值分别为27.81±0.26、29.74±0.34、28.47±0.41,单因素方差分析得出差异具有统计学意义（P<0.001）;抑制剂去除效果比较,Roche试剂盒、Qiagen试剂盒、Omega试剂盒的HAV 10倍稀释液与病毒原液的Ct值差值依次为3.21±0.13、3.19±0.19、3.13±0.20,Roche核酸提取试剂盒抑制去除效果略好（差值更接近3.3）。上述结果表明,A、B方法差距不大,在实际应用中可视情况而选择,在检测PCR抑制剂含量较高的贝类等食品标本时可采用C方法;在检测疫苗等RNA纯度较高的标本时,A、D方法差异不明显,D方法检测低浓度HAV污染的贝类食品时回收率较高,Roche 11858882001核酸提取试剂盒在检测人工污染牡蛎标本时表现较好。综上所述,对牡蛎前处理方法可选择蛋白酶K+PEG沉淀法,病毒回收率均较高;Roche 11858882001核酸提取试剂盒在提取贝类标本中HAV RNA时更有优势;检测食品中HAV RNA时,可根据实际情况采用A、B、C方法,在检测低浓度HAV污染食品时可选用D方法。