克罗恩病(Crohn’s disease, CD)是一种慢性炎性肉芽肿性疾病,病变可累及肠壁全层,肌层过度增厚和肠壁纤维化引起肠腔狭窄或梗阻,是CD患者选择手术治疗的主要原因。由于现阶段尚无有效阻断肠纤维化病变的治疗方法或药物,因此,寻求肠纤维化的替代疗法是临床迫切需要的。慢性或反复的炎症导致慢性或反复的组织损伤是促使肠纤维化发生的必要的先决条件。局部浸润的炎症细胞分泌大量炎症因子、细胞因子等,引起间质细胞活化、迁移和增殖并合成分泌大量胶原等细胞外基质(extracellular matrixc, ECM),过度沉积于肠壁起肠道纤维化。此外,最新研究使用遗传谱系追踪技术(genetic lineage tracing experiments)发现：在TNBS诱导的CD动物模型中,肠上皮细胞向间质细胞发生转化,提示上皮间质转化(Epithelial to mesenchymal transition, EMT)可能也参与了肠纤维化。因此,阻断成纤维细胞或肌成纤维细胞的来源及活化,抑制ECM的合成,是阻断肠纤维化发生和发展的关键所在。但目前对于ECM合成及EMT的确切细胞内信号机制尚不清楚。近年来,胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor-1,IGF-1)在胃肠道中的作用已引起广泛关注。在病理条件下,IGF-1参与肠道炎症、肿瘤迁移和肠道纤维化过程。TGF-β(transforming growth factor-β)在肠纤维化中的作用已有广泛的研究,而IGF-1在肠纤维化中的研究则较少,且机制尚不清楚。由于抗炎药物只能在炎症阶段抑制纤维化的发生,但是对于已发生纤维化的病变组织则没有延缓其进展的作用。目前研究显示,多酚类化合物——白藜芦醇(resveratrol, RSV)是NAD+依赖性组蛋白去乙酰化酶SIRT1 (silent mating type information regulation-1)的激动剂。研究表明,RSV可通过激活SIRT1对组蛋白或非组蛋白赖氨酸残基进行去乙酰化修饰来调节基因表达,参与细胞衰老、凋亡、分化等生理活动。研究报道,在肽聚糖-多糖(PG-PC)诱导的大鼠CD模型中,RSV能降低促炎细胞因子(IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β1)、Ⅰ、Ⅲ型前胶原和IGF-1 mRNA表达。因此,我们进一步推测,RSV可能通过激活SIRT1在肠纤维化过程中发挥保护作用。第—部分IGF-1对肠上皮细胞发生上皮间质转化的作用及机制目的：探讨胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor-1,IGF-1)对肠上皮细胞发生上皮间质转化(EMT)的作用及可能机制。方法：体外培养大鼠肠上皮细胞株(IEC-6),应用real-time PCR和western blot检测重组大鼠IGF-1对肠上皮细胞合成e-cadherin和vimentin的剂量效应(50、100、150ng/ml)和时间效应(24、48、72 h)。用细胞免疫荧光方法,检测IGF-1对肠上皮细胞膜上e-cadherin表达的影响,并用普通光学显微镜观察肠上皮细胞形态变化。检测IGF-1对肠上皮细胞IGF-1受体(IGF-1 receptor,IGF-1R)及下游信号分子Akt、ERK1/2、p38和JNK表达的时间效应(0,5,15,30,60min)。用IGF-1R小干扰RNA沉默IGF-1R表达后,检测IGF-1和IGF-1R 和 ERK1/2磷酸化和e-cadherin蛋白表达的影响。给予MAPK/ERK抑制剂U0126 (50μM)和PI3K/Akt抑制剂LY294002 (20μM),分别用vestern blot和细胞免疫荧光的方法检测IGF-1对e-cadherin表达的影响。结果：IGF-1呈时间依赖性下调e-cadherin蛋白表达,上调vimentin表达。IGF-1呈剂量依赖降低e-cadherin mRNA水平。光镜下,正常组肠上皮细胞呈现连接紧密的骰状或立方形；IGF-1处理48 h后,细胞间连接松散,细胞呈纺锤体形或三角形。细胞免疫荧光结果显示：较对照组,IGF-1处理后细胞膜上e-cadherin表达明显降低。以上结果提示IGF-1可诱导肠上皮细胞发生EMT,并呈时间和剂量依赖性下调e-cadherin表达。IGF-1可激活肠上皮细胞内IGF-1R, MAPK/ERK1/2, PI3K/Akt信号通路分子的活化,刺激5min时,IGF-1R磷酸化即升高,在30min时升高最显著；刺激15min,ERK1/2磷酸化水平升高,在30、60min时达最高；Akt磷酸化水平在30min时有升高；p38和JNK磷酸化水平没有显著改变。提示在肠上皮细胞中,IGF-1主要激活IGF-1R、MAPK/ERK、PI3K/Akt通路。IGF-1R表达沉默后,再给予IGF-1处理,IGF-1R和ERK1/2磷酸化水平降低,且e-cadherin表达升高。给予MEK1/2抑制剂U0126后,与IGF-1处理组相比,e-cadherin表达明显回升；而给予P13K抑制剂LY294002后,细胞膜上e-cadherin表达没有回升。上述结果提示IGF-1可能主要通过MAPK/ERK通路抑制e-cadherin表达。结论：IGF-1可能通过IGF-1R/MAPK/ERK通路抑制e-cadherin表达,促进肠上皮细胞发生EMT。第二部分IGF-I对肠道成纤维细胞迁移及合成I型胶原的作用及机制目的：探讨IGF-1对肠道成纤维细胞迁移和合成I型胶原的作用及可能的机制。方法：体外培养人正常结肠成纤维细胞株(CCD-18Co)和原代小鼠肠道成纤维细胞(]mouse intestinal fibroblasts,MIFs)。(1)在CCD-18Co细胞中,应用细胞划痕实验检测IGF-1对成纤维细胞迁移能力作用的时间效应(0,6,12,24,48h); western bolt和real-time PCR方法检测IGF-1对细胞合成N-cadherin的影响。IGF-1干预不同时间点,检测对IGF-1R、MAPK、PI3K/Akt信号通路的影响。给予PI3K/Akt通道抑制LY294002 (50μM或10、20、30μM)和MEK1/2抑制剂U0126 (50μM),检测对N-cadherin表达及细胞迁移能力的影响。(2)通过western blot和 real-time PCR检测IGF-1对成纤维细胞合成I型胶原的剂量效应(50、100、150ng/ml)和时间效应(0,24、48、72 h)。应用western blot检测IGF-1对成纤维细胞中IGFlR和下游信号分子ERK1/2磷酸化的影响。用MEK1/2抑制剂U0126阻断MAPK/ERK信号通路后,检测IGF-1对I型胶原合成的影响。结果：(1)IGF-1呈时间依赖促进肠道成纤维细胞迁移,并诱导钙黏附因子N-cadherin蛋白和mRNA表达。IGF-1激活IGF-1R、ERK1/2、Akt磷酸化,3Omin作用最明显。IGF-1对N-cadherin表达的促进作用能够被LY294002阻断,而U0126对其无显著影响。细胞划痕实验结果显示,LY294002能显著抑制IGF-1诱导的成纤维细胞迁移。(2)IGF-I诱导肠道成纤维细胞合成Ⅰ型胶原呈剂量和时间依赖性。IGF-1可磷酸化IGF-IR和下游信号分子ERK1/2,且MEK1/2抑制剂U0126能阻断IGF-1促Ⅰ型胶原表达的作用。提示IGF-1可能通过激活MAPK/ERK信号通路诱导Ⅰ型胶原合成。结论：(1)IGF-1可能通过PI3K/Akt通路促进N-cadherin表达,进而增强肠道成纤维细胞迁移能力。(2)IGF-1/IGF-1R/ERK轴可能是IGF-I诱导肠道成纤维细胞合成Ⅰ型胶原的主要通路。第三部分 白藜芦醇在IGF-1诱导肠纤维化中的保护作用及分子机制目的：探讨SIRT1激动剂——白藜芦醇(resveratrol, RSV)对IGF-1诱导肠道成纤维细胞合成I型胶原的干预作用及可能的分子机制。方法：(1)采用2,4,6-三硝酸苯磺酸(2,4,6-Trinitrobenzenesulfonic acid, TNBS)灌肠制备大鼠克罗恩病模型,通过DAI评分、HE染色和Masson染色验证成膜,并应用western bolt方法检测肠组织中I型胶原、IGF-1和SIRT1的蛋白水平,免疫组化检测SIRT1的表达变化和分布。(2)体外培养原代小鼠肠道成纤维细胞(MIFs)和人正常结肠成纤维细胞株(CCD-18Co)。在CCD-18Co细胞中,瞬时转染野生型SIRT1(SIRT1 WT)和酶失活缺失突变型SIRT1(SIRT1 H363Y)质粒,应用western blot检测SIRT1对I型胶原表达的影响。选择不同浓度RSV(50、100μM)处理MIFs和CCD-18Co细胞,用western blot 和 real time PCR检测I型胶原的蛋白和mRNA水平。用特异性SIRT1小干扰RNA (siRNA)沉默SIRT1表达后,检测RSV对I型胶原表达的影响。Western blot方法检测给予RSV或过表达SIRT1 WT后,IGF-1/-IGF-1R/ERK轴信号分子磷酸化水平的变化。结果：(1)在TNBS诱导的大鼠克罗恩病肠纤维化模型中,TNBS组出现明显炎症和纤维化改变,且I型胶原和IGF-1表达较对照组显著升高,而SIRT1蛋白水平明显降低(0.67±0.04 vs 1.05±0.07,P<0.001)。免疫组化结果显示,对照组SIRT1染色阳性细胞主要分布于粘膜肌层和固有肌层,粘膜固有层隐窝处和粘膜下层也有分布,且SIRT1主要定位于细胞胞浆；软件分析SIRT1染色阳性区域的积分光密度/面积(IOD/area)比值,TNBS组比值较对照组降低,差异有统计学意义(P<0.05)。(2)在成纤维细胞中,过表达SIRT1可降低I型胶原的表达,而SIRT1酶失活突变型质粒无明显作用。RSV能降低基础和IGF-1诱导下的I型胶原的合成。SIRT1干扰沉默后阻断了RSV对I型胶原合成的抑制作用。(3)RSV可抑制IGF-1诱导下IGF-1R和下游信号分子ERK1/2的磷酸化,但是过表达SIRT1对IGF-1R磷酸化没有影响,且SIRT1干扰后,RSV仍然能抑制IGF-1诱导下的I型胶原表达。结论：(1)动物模型中,病变肠组织中SIRT1水平降低可能参与肠纤维化。(2)体外细胞实验,证实RSV单独作用可能通过激活SIRT1抑制I型胶原的合成,且可能与S1RT1的去乙酰化酶活性有关。(3)RSV可抑制IGF-1诱导下I型胶原的合成,其机制可能是通过抑制IGF-1R磷酸化,进而抑制下游促胶原合成的MAPK/ERK信号通路,且该作用不依赖于SIRT1。