研究背景缺血性心脏病(IHD)是危害国人健康的重要疾病,及时恢复血流灌注是改善临床预后的最有效策略。但再灌注会加重单纯心肌缺血造成的损伤,即心肌再灌注损伤。如何最大限度减轻心肌缺血/再灌注(MI/R)损伤,提高缺血性心肌病救治效果,是心血管领域亟待解决的重要问题。因此,探寻再灌注损伤发生的分子机制,将为临床更好的救治急性心肌梗死提供理论依据。蛋白磷酸酶PHLPP,是目前发现的Akt特异性磷酸酶,可使Akt去磷酸化失活,进而促进细胞凋亡,抑制肿瘤的生长和增殖。近年来的研究表明,该蛋白磷酸酶家族中的一种异构体,PHLPP1,在心肌I/R损伤以及衰老心肌缺血易损性中扮演重要角色。然而,心肌I/R本身对PHLPP1蛋白表达的影响,及其调控机制,目前尚未见报道。此外,我们前期的工作证实,胰岛素可通过泛素蛋白酶体通路促进PHLPP1的蛋白降解,强化其心肌保护作用。研究表明,当胰岛素通路受损时,即肥胖伴有胰岛素抵抗病人骨骼肌中PHLPP1表达上调。提示PHLPP1与胰岛素抵抗关系密切。胰岛素抵抗是2型糖尿病的病理生理学基础。然而,糖尿病条件下,心肌中PHLPP1的变化及其在糖尿病心肌缺血易损性中的作用,目前仍不清楚。实验目的1.明确心肌I/R对PHLPP1表达的影响;进一步阐明影响心肌PHLPP1表达的具体分子机制。2.探讨PHLPP1在胰岛素抵抗心肌缺血易损性中的作用。实验方法1.心肌I/R调节PHLPP1表达的机制研究:采用10~12周龄雄性C57BL/6小鼠,构建急性心肌I/R模型,再灌注不同时间点(30 min,1 h,2 h,3 h,4 h)收集缺血区心肌组织。取1~3天龄SD大鼠,培养原代乳鼠心肌细胞,采用离体缺氧/复氧(H/R)模拟心肌I/R,缺氧4 h,在复氧不同时间点(1 h,2 h,3 h,4 h)收集心肌细胞;按照实验方案设计用TNF-α(20 ng/m L),H2O2(150μM)及相应抑制剂(依那西普:1μg/m L、NAC:5 m M)预处理心肌细胞。采用蛋白质免疫印迹方法检测相关蛋白表达。细胞免疫荧光染色方法观察转录因子NF-κB表达及其核转位。采用染色质免疫共沉淀(Ch IP)方法确定NF-κB与phlpp1基因上游启动子区域的相互作用。2.PHLPP1在糖尿病心肌缺血易损性中的作用研究:采用雄性ob/ob小鼠(10~12周龄)和同周龄的野生型C56BL/6小鼠,构建急性心肌I/R模型,缺血30 min,再灌注2 h取缺血区心肌组织检测蛋白表达,再灌注24 h检测心肌梗死面积。采用蛋白质免疫印迹实验检测蛋白表达水平,ELISA方法检测血清TNF-α水平。取缺血区心肌组织制备石蜡切片,采用免疫荧光染色和TUNEL染色方法检测蛋白表达及细胞凋亡。整体水平通过葡萄糖耐量实验(IPGTT)和胰岛素敏感性实验(IST)确定实验动物对胰岛素的反应性。培养乳鼠原代心肌细胞,采用高糖+胰岛素(Glucose:4,500 mg/L;Insulin:100 n M)长时间(24 h)预处理心肌细胞模拟胰岛素抵抗。心肌细胞转染PHLPP1特异si RNA,随后进行H/R处理,并检测细胞培养液上清中LDH水平。采用JC-1荧光染色方法观察线粒体膜电位变化情况,并用流式细胞术检测细胞凋亡。整体动物水平,分离心肌细胞线粒体,检测PHLPP1在细胞中的转位变化。实验结果1.I/R及H/R后心肌PHLPP1蛋白水平出现时程变化。整体动物水平,再灌注2 h心肌PHLPP1表达有上调趋势,但无统计学差异,而再灌注4 h PHLPP1蛋白水平明显降低;原代乳鼠心肌细胞缺氧/复氧模型中,复氧1 h心肌PHLPP1表达上调,复氧4 h时,PHLPP1蛋白水平明显减少;2.炎症和氧化应激共同调节PHLPP1蛋白表达。作为再灌注损伤的重要始动因素,炎症反应上调PHLPP1表达。采用重组TNF-α处理心肌细胞1 h显著上调PHLPP1蛋白水平,与之相比,TNF-α处理4小时PHLPP1蛋白水平有所减少;用TNF-α抑制剂依那西普(Etanercept)预处理心肌细胞,显著抑制TNF-α作用1 h PHLPP1的蛋白水平。H2O2诱导的氧化应激对PHLPP1表达无明显影响,但抗氧化剂NAC预处理心肌细胞可上调H2O2刺激4 h心肌PHLPP1蛋白水平。此外,短时间(1h)炎症因子和氧化应激共同作用与TNF-α单独刺激对PHLPP1蛋白水平的影响一致,表现为TNF-α的上调作用;二者共同作用时间延长至4 h,表现为H2O2的抑制作用。TNF-α抑制剂Etanercept预处理显著降低复氧1 h引起的PHLPP1高表达,而NAC预处理后PHLPP1的表达无明显改变;另一方面,抗氧化剂NAC预处理可以上调复氧4 h后心肌PHLPP1水平。3.TNF-α活化NF-κB核转位活性介导PHLPP1表达。TNF-α是激活经典NF-κB信号通路的重要配体。采用PDTC(NF-κB抑制剂)预处理显著降低TNF-α处理1小时引起的PHLPP1表达上调;相应地,PDTC使缺氧/复氧后PHLPP1的表达明显减少。随后找到phlpp1基因上游的启动子区域,通过软件预测,得到phlpp1基因启动子区域可能与转录因子NF-κB发生相互作用的片段:-83~-92(I),-884~-893(II),-1,383~-1,392(III)和-1,465~-1,474(IV)。采用染色质免疫共沉淀(Ch IP)方法,确定NF-κB与phlpp1启动子区域-1,383~-1,392(III)存在蛋白质与核酸之间的相互作用,而PDTC预处理可抑制二者间的结合。4.Ob/ob小鼠出现明显的全身胰岛素抵抗,并且,与野生型相比,ob/ob小鼠心肌I/R之后心肌梗死面积增加。同时,蛋白质免疫印迹与荧光染色结果均显示,ob/ob小鼠心肌PHLPP1本底水平明显上调,但心肌I/R之后PHLPP1蛋白表达减少。与之对应,采用原代乳鼠心肌细胞模拟胰岛素抵抗模型,此时心肌PHLPP1水平显著高于正常组。在此基础上给予H/R处理,PHLPP1表达出现一定程度的下调。5.胰岛素抵抗时,TNF-α介导心肌PHLPP1的表达。我们发现ob/ob小鼠血清中TNF-α水平远远高于野生型,而I/R后TNF-α含量显著降低。另一方面,模拟胰岛素抵抗心肌细胞中,NF-κB的磷酸化水平以及TNF-αm RNA水平显著高于Control组,但H/R后p NF-κB表达降低,与心肌PHLPP1的表达趋势一致。6.下调PHLPP1表达减轻胰岛素抵抗心肌细胞H/R损伤。采用si RNA下调PHLPP1蛋白水平,可使胰岛素抵抗心肌细胞本底及缺氧/复氧后培养基上清中LDH水平明显减少。流式细胞术及Caspase 3活化程度检测结果均显示,下调PHLPP1表达可减轻胰岛素抵抗心肌细胞缺氧/复氧导致的细胞凋亡。7.下调PHLPP1表达增强心肌细胞线粒体膜电位。线粒体膜电位下降是线粒体介导的细胞凋亡通路的标志性事件之一。采用JC-1荧光探针标记,观察线粒体膜电位变化。我们发现胰岛素抵抗心肌细胞线粒体膜电位下降,H/R后膜电位进一步降低。与之对应,采用si RNA抑制PHLPP1蛋白水平使胰岛素抵抗心肌细胞本底及H/R后线粒体膜电位明显上升。8.I/R增强ob/ob小鼠心肌PHLPP1向线粒体转位。心肌I/R后,野生型小鼠心肌细胞线粒体中PHLPP1表达上调;与之相比,ob/ob小鼠心肌细胞中PHLPP1向线粒体转位明显增加。结论1.心肌I/R及H/R过程中,炎症反应和氧化应激共同参与调控心肌PHLPP1表达。一方面,炎症因子TNF-α活化NF-κB向细胞核转位,介导PHLPP1的转录表达调控;另一方面,H2O2引起的氧化应激作用后期抑制PHLPP1表达。2.胰岛素抵抗ob/ob小鼠心肌I/R后PHLPP1向线粒体转位增强,后者抑制线粒体功能并促进心肌细胞凋亡,导致胰岛素抵抗心肌缺血损伤加重。