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研究背景与研究目的卒中是世界范围内导致死亡和残疾的主要原因之一,最常见的是缺血性卒中。目前认为唯一有效的治疗措施是时间窗内恢复血流,包括重组组织纤维蛋白溶酶源激活剂(recombinant tissue plasminogen activator,r-tPA)静脉溶栓和机械取栓治疗。但是狭窄的治疗时间窗(4.5h内)和相对较高的颅内出血风险限制了r tPA的临床应用。尤其是脑血流恢复后还可能进一步触发脑缺血/再灌注(ischemia/reperflusion,I/R)损伤,因此神经保护剂仍然被认为是治疗缺血性卒中的更有效的方法。缺血性损伤,尤其是脑血流恢复后触发的脑I/R损伤的病理生理机制非常复杂,包括能量代谢损害、谷氨酸或神经毒素释放、钙离子超载、炎症反应、氧化应激、细胞凋亡和自噬。因此针对单一靶点的药物或单纯应用一种神经保护剂不足以改善缺血性卒中的临床预后。目前越来越多的证据表明:炎症反应和自噬主要引起了脑I/R损伤的级联性损害。脑I/R损伤的动物模型已经证实调整脑内自噬过程可以改善其神经功能损害。除此之外研究证实脑脊液中自噬水平与缺血性卒中的预后相关。因此以上证据提示我们靶向作用于炎症和自噬过程的药物可能是有效治疗脑I/R损伤的有效措施。2013年美国心脏学会(American Heart Association,AHA)和美国卒中学会(American Stroke Association,ASA)联合颁布的急性缺血性卒中早期管理指南中,首次推荐他汀类药物做为神经保护剂。他汀类药物在脑I/R损伤的动物模型中通过减轻炎症损伤、调节血栓形成、改善内皮功能、促进血管生成、减少氧化应激发挥神经保护作用,这一点毫无争议。但是临床使用他汀类药物对缺血性卒中患者的预后改善仍然存在争论,究其原因可能是由于他汀使用的剂量和依从性导致,还可能是由于脑I/R损伤的复杂的病理生理机制引起的。另外,他汀类药物在其他疾病中已被证实可以通过调节自噬来改善疾病的预后,比如帕金森病、缺血性和非缺血性心肌病变、脊髓损伤以及哮喘;然而,迄今为止,没有任何证据可以证明他汀是否可以通过调整自噬过程来发挥对抗脑I/R损伤的神经保护作用。因此以上这些提示我们作用于自噬过程的药物可能会有效提高他汀对抗脑缺I/R损伤的神经保护作用。沉默信息调节因子(silent information regulator,SIR)基因(sirtuins)是一组从古细菌到高等真核生物均高度保守的烟酰胺腺苷酸核酸(nieotimide adenosine dinueleotide,NAD)依赖的去乙酰化酶。广泛存在于原核生物和真核生物中。在转录沉寂、信号转导、染色质稳定、双链DNA断裂损伤后生理修复等方面起重要作用,参与细胞周期、细胞凋亡、细胞分化及细胞寿命的调节。在所有的sirtuins中,SIRT1受到了最多的关注,它能够调节许多重要的信号通路,包括DNA修复和细胞凋亡,肌肉和脂肪分化,神经发生,线粒体生物发生,葡萄糖和胰岛素稳态,激素分泌,细胞应激反应和昼夜节律。合成或者天然的SIRT1激活剂(sirtuin activating compounds,STACs)可以抑制肿瘤生长、减缓炎症的发展、防治心血管疾病以及Ⅱ型糖尿病。在迄今为止发现的所有天然SIRT1激活剂中,白藜芦醇(Resveratrol,RES)(3,5,4’-三羟基-二苯乙烯)是最有效的。RES被证实具有保护大鼠免受脑I/R损伤的神经保护作用,其神经保护作用涉及到以下几种机制:抗炎、抗氧化应激、免疫调节和抗凋亡。更重要的是,RES被认为是天然的自噬调节剂。研究证实RES可以通过上调自噬水平缓解大鼠的脑I/R损伤。我们发现他汀类药物和RES在对抗脑I/R损伤的神经保护作用方面具有一些共同的通路。其中瑞舒伐他汀(Rosuvastatin,ROS)由于其低细胞毒性和多效性优于其他类型的他汀类药物,被广泛推荐用于缺血性卒中的一级和二级预防治疗。因此我们推测RES和ROS联合治疗可能具有协同对抗脑I/R损伤的神经保护作用。在本研究中,我们使用大鼠大脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)90分钟后再灌注24小时作为脑I/R损伤的动物模型。我们试图证实RES和ROS联合预处理对大鼠脑I/R损伤具有协同的神经保护作用,并探讨其可能的机制。研究方法1.SPF级健康成年雄性Sprague Dawley大鼠60只,体重200-220g,接受暂时性MCAO手术作为脑I/R损伤的动物模型。大鼠被随机分为4组(每组n = 15):MCAO模型对照组,单独RES预处理组,单独ROS预处理组,以及RES和ROS联合预处理组。RES(50mg/kg)通过腹腔注射给药,ROS(10mg/kg)通过灌胃给药,对照组大鼠则给予等量的生理盐水灌胃和二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO)腹腔注射。所有的药物治疗均为每天一次,在脑缺血发生前连续给药7天。2.再灌注24小时后,通过盲法检查者使用修正的神经学严重程度评分(modified neurological severity scores,mNSS)进行神经功能学评估,并通过3,5-三苯基四氮挫氯化物(3,5-Triphenyltetrazoliumchloride,TTC)染色法测定局部梗死体积。3.再灌注24小时后,用Western Blot法检测缺血侧脑组织内凋亡相关蛋白(Bax,Bcl-2,caspase-3),促炎细胞因子白介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)以及自噬相关蛋白(LC3Ⅱ,LC3Ⅰ和Becline-1)的表达水平。结果1.ROS联合RES预处理对脑I/R损伤具有协同保护作用与对照组相比,单独RES预处理、单独ROS预处理以及ROS联合RES预处理均能明显降低脑I/R损伤引起的脑梗死体积和神经功能学评分。更重要的是:ROS联合RES预处理组大鼠的脑梗死体积和神经功能缺损评分比单独RES预处理组或单独ROS预处理组更低。而单独RES预处理组和单独ROS预处理组在脑梗死体积和神经功能缺损评分方面并无显著性差异。这些结果提示缺血前ROS联合RES预处理具有协同保护脑I/R损伤的能力。2.ROS联合RES预处理在大鼠局灶性脑I/R损伤中具有协同抗凋亡作用我们发现:与对照组相比,单独RES预处理、单独ROS预处理以及ROS联合RES预处理均能显著增加缺血侧脑组织内Bcl-2的表达,并显著降低Bax和caspase-3表达。更重要的是,与单独RES预处理或单独ROS预处理相比较,ROS联合RES预处理能显著增加缺血侧脑组织内Bcl-2表达,并显著降低Bax和caspase-3表达,而且联合预处理能显著增加缺血侧脑组织内Bcl-2/Bax比率。然而单独RES预处理和单独ROS预处理在缺血侧脑组织内Bc1-2,caspase-3和Bax的表达上无显著性差异。因此,这些结果提示在大鼠局灶性脑I/R损伤中,缺血前ROS联合RES预处理的协同保护作用可能与其协同抗凋亡作用相关。3.ROS联合RES预处理在大鼠局灶性脑I/R损伤中具有协同抗炎作用我们western blot方法检测缺血侧脑组织内炎症因子白介素-1β(IL-1β)的含量。结果提示:与对照组相比,单独RES预处理、单独ROS预处理以及ROS联合RES预处理均能明显降低缺血侧脑组织内IL-1β含量。我们还发现:与单独RES预处理或单独ROS预处理相比较,ROS联合RES预处理能显著降低缺血侧脑组织内IL-1β含量。然而单独RES预处理和单独ROS预处理在缺血侧脑组织内IL-1β的表达上无显著区别。因此,这些结果提示在大鼠局灶性脑I/R损伤中,缺血前ROS联合RES预处理的协同保护作用可能与其协同抗炎作用相关。4.ROS联合RES预处理在大鼠局灶性脑I/R损伤中具有协同激活自噬的作用与对照组相比,单独RES预处理、单独ROS预处理以及ROS联合RES预处理能明显增加缺血侧脑组织内Becline-1的表达和LC3I1/LC3I比率。更重要的是我们还发现:与单独RES预处理或单独ROS预处理相比较,ROS联合RES预处理能显著增加缺血侧脑组织内Becline-1的表达和LC3II/LC3I比率。然而单独RES预处理和单独ROS预处理组在缺血侧脑组织内Becline-1的表达和LC3II/LC3I比率上无明显区别。因此,这些结果提示在大鼠局灶性脑I/R损伤中,缺血前ROS联合RES预处理的协同保护作用可能与其协同激活自噬相关。结论及意义:1.ROS可能通过增强自噬激活作为改善局灶性脑I/R损伤预后的潜在机制;2.ROS和RES联合治疗对于脑I/R损伤具有协同的神经保护作用,可能通过抗凋亡、抗炎以及激活自噬等途径来实现。