嗜线虫致病杆菌北京变种(Xenorhabdus nematophila var.pekingensis)CB6菌株是从北京郊区土壤中分离的小卷蛾斯氏线虫(Steinernema carpocaposae)肠道内所分离到的共生细菌,已经鉴定并定名。研究表明该菌株具有良好的杀虫活性。为挖掘这一本土细菌资源,本研究将其与另9个昆虫病原线虫共生细菌菌株进行了杀虫活性比较,对10个不同来源的昆虫病原线虫共生菌菌株胞内和胞外产物进行分离,将各产物的可溶性蛋白提取,并分别进行生物测定,结果表明CB6菌株产杀虫蛋白性能好。在此基础上以CB6菌株作为研究材料,分离纯化其胞内和胞外的杀虫活性蛋白,建立一套纯化该活性蛋白的技术参数,并对杀虫蛋白的特性进行了初步鉴定。现将主要研究结果总结如下: 1.测定的10个菌株发酵液均对棉铃虫和甜菜夜蛾幼虫有口服毒性,活性物质的产生部位在菌体胞内和胞外均有。不同菌种或同一菌种的发酵液、胞内或胞外产物和菌体碎片的杀虫活性不尽相同,一般胞内产物的活性要高于胞外。胞内胞外总蛋白的生测结果初步断定10个供试菌株所表现出的杀虫活性物质主要是蛋白类。 2.建立了一条有效纯化CB6菌株杀虫蛋白的技术路线,通过该纯化层析方案能获得纯化倍数较高的目标蛋白。其基本参数包括: 硫酸铵盐析:最佳硫酸铵饱和度为20～50%;离子交换层析:使用DEAE Sepharose FF层析柱,洗脱低盐为25mM Tris-HCl(pH7.4),高盐为1mol/L NaCl;洗脱高盐体积范围15～30%;疏水层析:使用Butyl FF层析柱,洗脱高盐为3mol/L NaCl+25mM Tris-HCl(pH7.4),低盐为25mM Tris-HCl(pH7.4)。凝胶层析:使用Sephacryl S-200 16/10层析柱,洗脱buffer:25mM Tris-HCl(pH7.4)。 通过该纯化技术路线所获得的目标蛋白浓度为4.134μg/mL,表现出对棉铃虫初孵幼虫97.9%的生长抑制率。 3.从CB6菌株胞内和胞外所获得的目标蛋白native-PAGE表明分子量都大于669kD,电泳带位置相同。该目标蛋白SDS-PAGE表明,2个目标蛋白都只出现一条分子量约为220kD的带。纯化该目标蛋白的层析技术完全相同。这说明CB6菌株胞内和胞外所产的目标蛋白可能是同一种蛋白。 4.目标蛋白的紫外吸收光谱在250～290nm下有吸收值。蛋白染色试验结果表明,目标蛋白不是脂蛋白,也不是糖蛋白。 CB6菌株发酵液中具有杀虫活性的物质为蛋白质,该种蛋白质具有较高的生物活性,严重抑制棉铃虫幼虫的取食和生长发育。本研究首次报道了CB6菌株胞内和胞外所产杀虫蛋白具有相似性,为开展胞内胞外杀虫蛋白的来源关系的研究奠定基础。本研究所建立的纯化该类杀虫蛋白的技术路线,为研究该菌株杀虫蛋白的作用机理以及为该杀虫蛋白基因的克隆提供了依据和基础。