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研究目的:胃癌在恶性肿瘤中是属于发病率和死亡率均比较高的癌种,早期诊断及早期治疗较为困难,确诊时往往处于疾病进展期或是晚期,预后较差。胃癌本身异质性明显,恶性程度高,易发生血行转移及腹腔种植转移,虽然胃癌根治性手术可以做到淋巴结清扫,但对血行转移等其他远处转移作用局限,而血行转移又是多数患者的主要死因,也是其持续高病死率的重要原因。因此,明确胃癌发生血行转移的相关原因不仅是一种基础研究问题,更能为临床医生在日常的诊疗活动中提供建设性的指导意见,意义非凡。肿瘤开始进行血行转移的关键步骤是游离的肿瘤细胞渗透进入血管壁,而肿瘤细胞是如何内渗入血管,进入血液循环尚不清楚。本研究旨在探讨胃癌的一种可能的血行转移机制,并研究参与该过程的关键分子和信号通路。研究方法:1.Transwell实验筛选出侵袭能力不同的胃癌细胞株;2.利用差速超速离心法对所选出3组胃癌细胞培养液的上清液中的囊泡进行提取;3.采用透射电子显微镜鉴定所提取囊泡的膜结构,形状以及直径;4.蛋白质免疫印迹实验用于检测外泌体表面特异性蛋白标志物;5.鉴定证实所提取的囊泡为外泌体后用PKH67标记外泌体,并将标记好的外泌体与人脐静脉血管内皮细胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cell,HUVEC）共培养进行外泌体的示踪,证实外泌体可以被靶细胞HUVEC摄取;6.通过transwell检测不同侵袭能力的胃癌细胞来源外泌体作用于HUVEC后对其通透性的影响;7.通过CCK-8法检测外泌体作用于HUVEC后对其增殖能力及活性的影响;8.通过Western blot检测不同侵袭能力的胃癌细胞来源外泌体作用于HUVEC后P120-catenin和VE-cadherin的变化;9.对筛选的外泌体进行micro RNA深度测序,结合生物信息学分析及文献,筛选可能的目的miRNA;10.通过实时荧光定量PCR来进一步验证外泌体的micro RNA测序结果;11.HUVEC转染效率及转染条件的验证;12.构建目的miRNA:let-7b-5p的类似物mimics,抑制物inhibitor以及对应的阴性对照,验证let-7b-5p是否能够增加血管内皮通透性;13.通过CCK-8法检测let-7b-5p对HUVEC增殖能力的影响;14.验证let-7b-5p inhibitor逆转胃癌细胞来源外泌体增加血管内皮通透性的作用;15.CCK-8法验证let-7b-5p inhibitor与外泌体对HUVEC增殖能力的影响;16.流式细胞术检测let-7b-5p inhibitor与外泌体对HUVEC凋亡的影响;17.结合生物信息学筛选let-7b-5p的靶基因及双萤光素酶报告基因实验验证作用位点;18.蛋白质免疫印迹实验检测let-7b-5p对VE-cadherin,P120-catenin和MAPK6/ERK3表达的影响;19.通过慢病毒过表达HUVEC中的MAPK6/ERK3并通过Western blot验证;20.通过transwell验证胃癌细胞外泌体中let-7b-5p通过MAPK6/ERK3增加HUVEC的通透性;21.通过体内实验验证胃癌细胞外泌体增加血管内皮通透性促进转移的作用。研究结果:1.在相同条件下,AGS和MGC80-3的侵袭能力明显高于MKN45和NCL-N87。2.提取相对侵袭能力为高-中-低的AGS,MGC80-3和NCL-N87细胞的外泌体,通过透射电子显微镜鉴定所提取的囊泡样小体,直径处于30-150 nm之间,具有典型的双层膜结构。3.所提取囊泡的CD9、CD63及TSG101等3种外泌体标志物均阳性表达,证实所提取囊泡样小体即为胃癌细胞来源的外泌体。4.将外泌体（PKH67标记）与DAPI标记的HUVEC进行共同培养24小时后,利用激光共聚焦显微镜观察细胞,证实外泌体被HUVEC摄取。5.与空HUVEC相比,经外泌体处理后的HUVEC通透性明显增加,且高侵袭性胃癌细胞来源外泌体的这种增加HUVEC通透性的作用更强,P＜0.0001,即胃癌细胞来源外泌体显著增加血管内皮通透性,差异具有统计学意义。6.和空细胞组相比较,HUVEC-AGS外泌体组的细胞增殖能力显著地降低,P＜0.0001,而HUVEC-NCI-N87外泌体组、HUVEC-MGC80-3外泌体组的细胞增殖能力增加,P＜0.0001,P=0.0002。7.Western blot的结果显示HUVEC,HUVEC-AGS、HUVEC-NCI-N87、HUVEC-MGC80-3样品中P120-catenin的相对表达量未见明显差异,P＞0.05。与HUVEC样品相比,HUVEC-MGC80-3组中VE-cadherin蛋白的相对表达量明显升高,P＜0.05,而其他组未见明显变化。8.通过外泌体micro RNA深度测序,筛选差异明显的miRNA,根据生物信息学筛选,结合查阅文献,分析其在各个领域中的作用,锁定了目标基因为let-7b-5p。9.实时荧光定量PCR结果显示3组外泌体均有目的基因的扩增,同时在let-7b-5p的相对表达量方面,AGS外泌体组＞MGC80-3外泌体组＞NCL-N87外泌体组。10.转染预实验提示FAM NC转染HUVEC细胞4-6小时,最高转染效率达到60%,考虑到毒性小及细胞状态情况,选择FAM NC（2.5μl）:lipo2000（2μl）为后续实验转染条件。11.与HUVEC-mimics NC相比,转染了let-7b-5p类似物的HUVEC通透性明显增加,P＜0.0001;同时,与HUVEC-inhibitor NC相比,转染了let-7b-5p抑制物的HUVEC通透性明显降低,P＜0.0001。12.和对照组（NC）相比较,HUVEC-let-7b-5p实验组的细胞增殖能力显著下降,但下降比例不足10%;和inhibitor NC组相比较,HUVEC-let-7b-5p inhibitor实验组的细胞增殖能力显著下降,但下降比例不足10%。13.与HUVEC inhibitor-NC相比,HUVEC-let-7b-5p-inhibitor组的细胞通透性明显降低,P＜0.0001;同HUVEC-let-7b-5p-inhibitor组相比,HUVEC-inhibitor+AGS-Exo;HUVEC-inhibitor+MGC80-3-Exo;HUVEC inhibitor+NCL-N87-Exo等外泌体处理组并未表现出明显的通透性增加,P＞0.05。14.与HUVEC-let-7b-5p-inhibitor组相比,HUVEC inhibitor-NC组增殖能力下降,P＜0.001;HUVEC-inhibitor+NCL-N87-Exo20/50组;HUVEC-inhibitor+MGC80-3-Exo 20/50组增殖能力亦有下降,P＜0.001;而HUVEC inhibitor+AGS-Exo 20/50组未见明显差异。15.与HUVEC-let-7b-5p-inhibitor组比,HUVEC inhibitor-NC组的凋亡减少,P＜0.01;HUVEC-inhibitor+AGS-Exo20/50组的凋亡明显增加,P＜0.001;HUVEC-inhibitor+MGC80-3-Exo 20/50组凋亡显著增加,P＜0.001;HUVEC inhibitor+NCL-N87-Exo 20组的凋亡显著增加,P＜0.01,而HUVEC inhibitor+NCL-N87-Exo 50组的凋亡却未见明显差异。16.let-7b-5p可以调控带有MAPK6/ERK3 3′UTR的luciferase的表达（P=0.0008）,下降29.21%;而在结合位点突变后（CUACCUCA→GAUGGAGU）,这种调控关系消失。17.VE-cadherin:与HUVEC-mimics NC样品相比,HUVEC-let-7b-5p mimics组的蛋白表达含量未见明显差异,P＞0.05;与HUVEC-inhibitor NC相比,HUVEC-inhibitor样品中VE-cadherin蛋白的表达量明显下降,P＜0.0001。P120-catenin:与HUVEC-mimics NC样品相比,HUVEC-let-7b-5p mimics组的蛋白表达含量未见明显差异,P＞0.05;与HUVEC-inhibitor NC相比,HUVEC-inhibitor样品中P120-catenin蛋白的表达量明显降低,P＜0.0001。MAPK6/ERK3:与HUVEC-mimics NC样品相比,HUVEC-let-7b-5p mimics组蛋白表达含量未见明显差异,P＞0.05;与HUVEC-inhibitor NC相比,HUVEC-inhibitor样品中MAPK6/ERK3蛋白的表达量明显升高,P＜0.0001。18.Western blot检测MAPK6/ERK3过表达的效率,研究结果显示MAPK6/ERK3在HUVEC中呈现过表达。19.空白对照（HUVEC-NC+Exo）和阴性对照组（HUVEC-E+Exo）的通透性未见明显差异,P＞0.05。而实验组的通透性较两个对照组均明显减低,P＜0.0001,可以认为let-7b-5p是通过MAPK6/ERK3增加了血管内皮的通透性。20.动物实验显示胃癌细胞来源外泌体更能促进裸鼠腹腔转移瘤的形成,无论是在转移结节数目上或是转移结节的大小方面,均存在显著差异,具有统计学意义。研究结论:1.胃癌细胞来源外泌体可以增加血管内皮的通透性。2.外泌体的这种作用能力与其来源的胃癌细胞的侵袭性相关,即侵袭性强的胃癌细胞,其分泌的外泌体增加血管内皮通透性的能力随之增强。3.Hsa-let-7b-5p是胃癌细胞来源外泌体增加血管内皮通透性的关键性分子,MAPK6/ERK3是其下游靶基因。4.胃癌细胞来源外泌体中Hsa-let-7b-5p通过下调MAPK6/ERK3,激活MAPK信号通路来增加血管内皮的通透性,这可能和胃癌血行转移相关。5.MAPK6/ERK3与血管内皮通透性相关的具体作用方式和血管内皮细胞本身的增殖,凋亡无关,可能存在其他潜在的机制,值得深入探讨。