青钱柳黄酮的测定方法与提取分离及其生物活性研究

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青钱柳Cyclocarya paliurus(Bata1.)Iljinskaja.系双子叶植物纲(Dicotyledoneae)胡桃科(Juglandaceae)植物,青钱柳属。青钱柳茶可有效地用于防治糖尿病、高血压、冠心病、神经衰弱等疾病,被称之为“降糖神茶”。研究表明,这些生理活性与青钱柳中所含的黄酮、三萜以及多糖等活性成分有关。目前对青钱柳黄酮还未见深入研究,这极大的影响了青钱柳的有效利用。因此本文对青钱柳黄酮的提取、测定、分离纯化以及抗氧化和保肝活性进行了系统研究,为青钱柳及其活性成分的有效利用及综合开发提供了理论基础。主要研究内容与结论概括如下:1.建立了青钱柳中总黄酮含量测定方法。通过对直接测定法、三氯化铝显色法和硝酸铝显色法三种测定方法的比较,发现三氯化铝显色法精密度高,重现性,稳定性和回收率效果较好,更适合青钱柳中总黄酮含量的测定。2.探索了青钱柳总黄酮的提取工艺。采用正交L9(34)实验对乙醇回流提取青钱柳总黄酮的工艺条件进行了优化得出最佳工艺条件。最佳条件下得到总黄酮含量为22.04mg/g。采用四因素二次旋转回归试验对微波辅助提取青钱柳总黄酮的工艺条件进行了优化得出最佳提取条件。最优条件下所得黄酮含量的实测值为15.6437mg/g。两种方法比较得出:溶剂回流提取法的总黄酮得率要高于微波辅助提取,但微波辅助提取操作方便,提取时间短,大大降低了成本,节省了能源。3.对青钱柳黄酮类化合物的分离纯化和结构鉴定进行了研究,采用大孔吸附树脂结合制备液相色谱技术从青钱柳乙醇提取物中分离得到3个黄酮苷类单体物质,经IR、ESI-MS和NMR鉴定,分别为槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖醛酸苷(Ⅰ),山柰酚-3-O-β-D-吡喃葡萄糖醛酸苷(Ⅱ)和山柰酚-7-O-α-L-鼠李糖苷(Ⅲ)。大孔吸附树脂结合制备液相色谱技术高效快速,通量大,适合青钱柳总黄酮分离,目前关于这方面的研究还未见报道。4.对青钱柳提取物的活性进行了体外实验研究。实验结果表明,青钱柳提取物具有较强的清除DPPH自由基、超氧自由基和羟基自由基的能力,并与样品使用浓度呈明显的量效关系。70%乙醇提取物对油脂的氧化具有一定抑制作用,但是弱于天然抗氧化剂VE和BHT。结果表明青钱柳具有较强的体外抗氧化特性。5.考察了青钱柳提取物对肝纤维化小鼠的保护作用。建立CCl4诱导的急性小鼠肝损伤模型,用试剂盒测定血清中ALT和AST的活性,肝脏中的脂质过氧化物(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和肝脏总抗氧能力(T-AOC)来研究青钱柳提取物对CCl4诱导小鼠肝毒性的保护作用。结果表明:青钱柳具有保肝作用,但保肝机理尚不明确,还有待于进一步研究。
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