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在哺乳动物免疫系统中,白细胞介素10(Interleukin-10,IL-10)被认为是具有多重功能的重要细胞因子。IL-10由多种细胞分泌并作用于各种免疫细胞,如T细胞、B细胞、单核/巨噬细胞和树突状细胞,调控这些细胞的生长、成熟、增殖、分化与活化,进而影响机体的天然免疫和获得性免疫,并与其它细胞因子一起维持了免疫系统的稳定。硬骨鱼IL-10在多种鱼类包括斑马鱼、金鱼、鲤鱼和虹鳟中被克隆鉴定,但有关硬骨鱼IL-10的免疫调节功能知之甚少,其受体和细胞信号传导途径,以及作用机制均有待阐明。本论文研究草鱼IL-10的免疫学功能,不仅揭示其保守的抑炎症功能,而且阐明它和另一经典抑炎症细胞因子TGF-β1参与免疫反应调节的相互关系和作用机制,从而拓展了对鱼类IL-10免疫学地位的认识。另外,为了解草鱼IL-10发挥作用的分子机制,进一步鉴定了草鱼IL-10介导的IL-10受体1(IL-10R1)和IL-10受体2(IL-10R2)及其下游信号通路(STAT3)和靶基因细胞因子信号转导负调控蛋白3(Suppressor of cytokine signaling 3,SOCS3)。为获悉草鱼IL-10的产生机制,初步探讨了LPS和IFN-γ对草鱼IL-10的转录调控机制。具体研究内容如下:1.重组草鱼IL-10蛋白的活性鉴定和参与的免疫刺激作用:(1)通过硬骨鱼同源序列比对克隆获得草鱼IL-10 cDNA全长序列,并用生物信息学方法分析其结构域与保守特性。(2)实时荧光定量PCR(qPCR)方法检测草鱼IL-10在各组织中的表达,结果表明草鱼IL-10主要在免疫相关组织头肾、肾、鳃中有较高表达,提示草鱼IL-10可能参与免疫相关反应。(3)构建原核表达系统并采用亲和纯化法获得高纯度重组草鱼IL-10蛋白,利用此蛋白研究草鱼IL-10免疫学功能。(4)细胞活性检测结果表明草鱼IL-10能够促进外周血淋巴细胞PBLs的细胞活性。相似地,转化生长因子β1(Transforming growth factorβ1,TGF-β1)也能促进PBLs的细胞活性。(5)为揭示上述作用的机制,采用草鱼IL-10免疫中和实验发现草鱼TGF-β1是依赖于IL-10发挥上调PBLs细胞活性的作用。(6)上述结论得到进一步支持,即qPCR和竞争抑制酶联免疫吸附(CI-ELISA)实验表明草鱼TGF-β1促进IL-10的mRNA表达和蛋白分泌水平,从而证明TGF-β1可能通过诱导IL-10的产生来上调PBLs的细胞活性。本章证明了重组草鱼IL-10的免疫刺激作用,特别是揭示了鱼类TGF-β1和IL-10在发挥免疫刺激作用中的上下游关系。2.草鱼IL-10和TGF-β1在炎症反应调节中的作用和相互关系:(1)在草鱼头肾单核/巨噬细胞中,加入的草鱼il-10和tgf-β1均抑制lps刺激促炎症信号因子tnf-α、il-1β、inos和il-8的表达。(2)相反地,草鱼il-10和tgf-β1的抗体均放大lps对上述促炎症信号因子mrna的上调作用,提示内源的il-10与tgf-β1发挥了抑制促炎症因子表达的作用。(3)机制研究发现,草鱼il-10与tgf-β1均能促进草鱼iκbα全蛋白的表达,即抑制iκbα的降解从而抑制nf-κb通路的激活,表明草鱼tgf-β1和il-10可能通过抑制nf-κb信号通路控制lps诱导的促炎症因子表达。(4)草鱼il-10抗体和tgf-β1抗体分别对tgf-β1和il-10的调节作用不产生影响,提示在lps激活的头肾单核/巨噬细胞中,tgf-β1与il-10独立发挥抑制功能。这些结果验证了鱼类il-10的抑炎症作用及其机制,以及与另一抑炎症因子tgf-β1平行发挥作用的关系,从而丰富了鱼类炎症反应控制机制的知识。3.草鱼il-10受体及信号通路的鉴定:(1)采用同源克隆技术获得了草鱼il-10受体1(il-10r1)、细胞因子受体家族成员4(cytokinereceptorfamilymember4,crfb4)以及细胞因子受体家族成员5(crfb5),并进行了生物信息学分析。(2)qpcr检测结果表明草鱼il-10r1表达于鳃、胸腺、脾、头肾等免疫相关组织,而草鱼crfb4与crfb5则广泛表达于各检测组织,展现出与哺乳动物同系基因类似的表达特性。(3)构建这三种受体的真核表达质粒,在草鱼肾细胞系cik中,通过对stat3控制的荧光素酶的活性检测,证明了草鱼il-10r1在il-10信号传导中的必要地位,以及草鱼il-10能够上调stat3的活性。更重要的,首次证明了crfb4而不是crfb5作为草鱼il-10r2。(4)分离克隆草鱼socs3启动子区域,并构建草鱼socs3启动子荧光素酶报告质粒及其stat结合位点的突变体,荧光素酶的活性检测表明草鱼stat3介导il-10对socs3启动子活性的上调作用。(5)在原代细胞草鱼头肾白细胞hkls中,免疫印迹和qpcr结果证明草鱼il-10激活stat3信号通路并介导socs3mrna的表达。这些工作阐明了草鱼il-10调节靶基因socs3转录的il-10r1/crfb4/stat3信号通路。4、草鱼il-10的转录调控分析:(1)在草鱼头肾单核/巨噬细胞中,lps通过mapk/erk和nf-κb信号通路上调il-10mrna表达。(2)在草鱼头肾单核/巨噬细胞中,重组草鱼ifn-γ抑制il-10mrna的表达,参与的信号通路为mapk/erk。(3)lps上调草鱼il-10启动子活性,而重组草鱼ifn-γ抑制il-10启动子的活性。这些实验结果表明,不同的刺激作用通过不同的信号途径调控il-10的表达。本论文揭示了草鱼il-10的免疫调节功能,包括刺激免疫细胞活性的新发现和在炎症反应中的经典抑制功能,特别明确了两种重要抑炎症因子il-10与TGF-β1在上述调节作用中的相互关系和作用机制,鉴定了草鱼IL-10的特异受体IL-10R1和辅助受体CRFB4,阐明了草鱼IL-10激活STAT3信号通路和靶基因SOCS3,且探讨了不同诱导条件下IL-10的转录调控机制。本论文的结果不仅填补了硬骨鱼IL-10功能特性、相关作用机制和信号通路等重要信息,而且揭示了基于不同细胞因子相互关系的鱼类免疫调节新机制。