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锑是一种剧毒的重金属元素,对生物体具有很强地毒害作用,已被国际癌症研究机构列为致癌物质。我国的锑矿资源最为丰富,锑污染问题也日趋严重。然而某些微生物在高浓度的锑环境中能够正常地生长和繁殖,有的甚至将锑作为能源物质,或是将高毒性的Sb(Ⅲ)氧化成低毒性的Sb(V),从而降低环境中锑污染物的毒性。前期研究发现,Agrobacterium tumefaciens 5A中的砷氧化酶AioBA具有Sb(Ⅲ)氧化功能,当缺失砷氧化酶基因aioA后,5A的Sb(Ⅲ)氧化速率降低了约1/3。通过序列比对,Agrobacterium tumefaciens GW4中的砷氧化酶AioBA与Agrobacterium tumefaciens 5A具有很高的同源性,相似性高达93%。推测,Agrobacterium tumefaciens GW4中的砷氧化酶AioBA也具有Sb(Ⅲ)氧化功能。并且,在前期的实验研究中已经获得了砷氧化酶AioBA缺失突变株GW4-△aioA及其互补株GW4-△aioA-C。因此,本课题通过研究菌株GW4、GW4-△aioA和GW4-△aioA-C的Sb(Ⅲ)氧化、趋化和能量代谢来阐明锑氧化菌GW4中砷氧化酶AioBA对锑氧化、趋化和能量代谢的影响。根据生长、氧化和抗性实验结果,当砷氧化酶基因aioA缺失后,GW4的生长和Sb(Ⅲ)抗性没有受到显著影响,但其Sb(Ⅲ)氧化速率并没有出现下降,甚至稍有加快。并且,通过平板游动法实验还发现,相比于野生株,突变株GW4-△aioA对Sb(Ⅲ)表现出更强地正向趋化能力。于是,根据生长实验和氧化实验结果,选取生长32h(对数期)时样品的总蛋白质进行双向电泳,通过质谱成功鉴定得到了21个差异表达的蛋白质。根据KEGG代谢路径分析发现:与各种类型代谢相关的蛋白质占59%,与各种遗传信号转导相关的蛋白质占3%,与各种环境信息传递相关的蛋白占20%,与各种细胞进程相关的蛋白质占3%,而功能未明确的蛋白质占15%。同时,根据差异蛋白的功能进行了功能分类。最后在质谱鉴定结果的基础上,结合qRT-PCR等研究手段分析菌株GW4和GW4-△aioA的代谢差异。通过分析结果发现:(1)当敲除GW4的砷氧化酶基因aioA后,其锑氧化酶AnoA参与的Sb(Ⅲ)氧化酶促反应和H202参与的Sb(Ⅲ)氧化非酶促反应均会增强,弥补了砷氧化酶AioBA的Sb(Ⅲ)氧化功能,最终造成GW4-△aioA的Sb(Ⅲ)氧化速率没有下降,甚至稍有加快;(2)在加锑条件下,相较于野生株GW4,突变株GW4-△aioA的氨基酸代谢上调表达;(3)相比于不加锑条件下,在加锑条件下,野生株GW4的碳代谢上调表达,并且在菌株GW4-△aioA中会进一步上调表达;(4)通过高效液相检测发现,Sb(Ⅲ)能诱导菌株GW4产生更多的ATP和NADH,并且菌株GW4-△aioA胞内生成的ATP和NADH含量比菌株GW4的高;(5)通过微量热仪检测发现,在加锑条件下,菌株GW4-△aioA释放的微量热比菌株GW4的多,互补株GW4-△aioA-C的表型也基本回复。对整体结果的综合分析表明砷氧化酶AioBA的缺失影响了菌株GW4的Sb(Ⅲ)氧化、趋化和能量代谢。其中锑氧化酶AnoA参与的Sb(Ⅲ)氧化酶促反应与H2O2参与的Sb(Ⅲ)氧化非酶促反应均增强,这可能是由于砷氧化酶AioBA的缺失导致菌株GW4的锑代谢发生了变化,参与锑氧化酶AnoA和H2O2氧化Sb(Ⅲ)的过程的调控因子可能直接或间接地受到了影响。同时,参与Sb(Ⅲ)趋化的调控因子也可能受到了影响。Sb(Ⅲ)氧化和趋化作用的增强可能促进了菌株GW4的TCA循环,从而产生了更多的ATP和NADH,用于抵御锑的毒害。在锑代谢的过程中,消耗的能量的一部分最终以热量的形式释放出来。该论文的结果解释了一种细菌锑氧化的解毒机制,具有重要理论价值。