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第一部分抑制外泌体分泌对快速心房起搏犬心房电生理特性和心房颤动诱发的影响目的:探讨抑制外泌体分泌对快速心房起搏犬心房电生理特性和心房颤动（房颤）诱发的影响。方法:经颈静脉途径右心耳植入高频起搏器建立快速心房起搏模型。20只比格犬被随机分为三组:假手术组（n=6）、快速心房起搏组（RAP组,n=7）和RAP+外泌体合成/释放抑制剂GW4869组（RAP+GW4869组,n=7）。假手术组右心耳植入起搏但不起搏;RAP组和RAP+GW4869组右心耳植入起搏器后快速心房起搏7天（450次/分）;RAP+GW4869组快速心房起搏的同时每天静脉注射外泌体抑制剂GW4869（0.3 mg/kg/d,每天一次）。所有犬在试验终点时通过在体电生理监测心房有效不应期（atrial effective refractory period,AERP）和房颤诱发情况;取静脉血分离外泌体,通过透射电镜、纳米粒径分析（nanoparticle tracking analysis,NTA）以及western blotting对外泌体形态、粒径分布及标志蛋白表达等特征进行鉴定;处死动物后迅速取心房组织,检测心房外泌体分泌相关蛋白（Rab27a）及标志蛋白（CD63、CD81、TSG101）表达水平。结果:外泌体特征鉴定显示各组分离的血浆外泌体主要表现为直径30-150nm的囊泡状结构,表达CD63、CD81等标志蛋白。与假手术组相比,RAP组右心房快速起搏7天后血浆外泌体浓度明显升高（P＜0.05）;与RAP组相比,RAP+GW4869组外泌体分泌被抑制（P＜0.05）,假手术组和RAP+GW4869组之间差异无统计学意义。与假手术组相比,RAP组心房外泌体分泌及标志蛋白（Rab27a、CD63、CD81、TSG101）表达水平显著升高（P＜0.01）;与RAP组相比,RAP+GW4869组上述蛋白表达水平降低（P＜0.01）。与假手术组相比,RAP组起搏7天后左、右心房和四个肺静脉AERP均明显降低（P＜0.01）,AERP离散度增加（P＜0.01）;而与RAP组相比,RAP+GW4869组AERP延长,AERP离散度减小（P＜0.05）;假手术组和RAP+GW4869组之间差异无统计学意义。与RAP组相比,给予GW4869可明显减少右心房快速起搏后的房颤诱发次数,缩短房颤维持时间（P＜0.01）。结论:快速心房起搏增加犬血浆和心房外泌体分泌,抑制外泌体分泌能明显逆转起搏犬心房电重构,减少房颤诱发。第二部分抑制外泌体分泌对快速心房起搏犬心房基质的影响目的:探讨抑制外泌体分泌对快速心房起搏犬心房基质的影响。方法:经颈静脉途径右心耳植入高频起搏器建立快速心房起搏模型。20只比格犬被随机分为三组:假手术组（n=6）、快速心房起搏组（RAP组,n=7）和RAP+外泌体合成/释放抑制剂GW4869组（RAP+GW4869组,n=7）。假手术组右心耳植入起搏器但不起搏;RAP组和RAP+GW4869组右心耳植入起搏器后快速心房起搏7天（450次/分）;RAP+GW4869组快速心房起搏的同时每天静脉注射外泌体抑制剂GW4869（0.3 mg/kg/d,每天一次）。实验结束后处死动物迅速取心房组织,western blotting检测心房Ⅰ型胶原蛋白（collagenⅠ,Col I）、Col III、基质金属蛋白酶2（matrix metalloproteinase-2,MMP2）、MMP9、组织金属蛋白酶抑制因子3（tissue inhibitors of metalloproteinase-3,TIMP3）、转化生长因子-β1（transforming growing factor-β1,TGF-β1）、NOD样受体蛋白3（NOD-like receptor protein-3,NLRP3）蛋白水平;ELISA检测心房组织白介素-6（Interleukin-6,IL-6）、IL-1β、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）含量;RT-PCR检测心房组织中IL-6、TNF-α和微小核糖核酸-21-5p（micro RNA-21-5p,miR-21-5p）以及血浆外泌体中miR-21-5p相对表达水平;组织固定后,Masson三色法染色评估心房纤维化程度,α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）免疫组化显示心房成纤维细胞激活情况,CD68免疫荧光观察心房组织巨噬细胞浸润情况,NLRP3和α-actinin免疫荧光分析心房肌NLRP3炎性小体激活情况。结果:Masson染色和α-SMA免疫组化结果表明,快速心房起搏7天后心房胶原纤维沉积和成纤维细胞激活较假手术组增加,而给予GW4869可明显减轻快速心房起搏所致的心房胶原纤维沉积和成纤维细胞的激活（P＜0.01）。与假手术组相比,RAP组和RAP+GW4869组心房Col I、Col III、MMP2、MMP9、TGF-β1蛋白水平均明显升高（P＜0.05）,而TIMP3蛋白水平显著降低（P＜0.01）;与RAP组相比,外泌体抑制剂GW4869显著缓解了右心房快速起搏引起的心房Col I、Col III、MMP2、MMP9、TGF-β1蛋白水平的升高和TIMP3蛋白水平的降低（P＜0.01）。与假手术组相比,RAP组和RAP+GW4869组血浆外泌体和心房中miR-21-5p的相对水平均明显升高（P＜0.05）;与RAP组相比,RAP+GW4869组血浆外泌体和心房中miR-21-5p的相对水平降低（P＜0.05）。与假手术组相比,右心房快速起搏后心房IL-6和TNF-α水平明显增加（P＜0.01）;GW4869治疗降低了快速心房起搏所致的心房IL-6和TNF-α水平的升高（P＜0.01）。CD68免疫荧光和i NOS m RNA相对水平分析结果表明,与假手术组相比,RAP组和RAP+GW4869组促炎型巨噬细胞浸润增加（P＜0.01）;与RAP组相比,GW4869降低了心房促炎型巨噬细胞的浸润（P＜0.01）。NLRP3免疫荧光及western blotting结果表明,与假手术组相比,RAP组心房NLRP3表达水平升高（P＜0.01）,GW4869治疗降低了起搏后心房NLRP3的表达水平（P＜0.01）。结论:快速心房起搏可引起心房纤维化、炎症反应、巨噬细胞浸润以及NLRP3炎性小体激活等心房基质的改变,抑制外泌体分泌可能通过减轻心房基质的上述改变减少房颤的诱发和维持。第三部分M1巨噬细胞来源的外泌体通过miR-155-5p/sirt1通路影响心肌细胞炎性小体的表达目的:探讨巨噬细胞来源的外泌体是否可调节心肌细胞NLRP3炎性小体的表达,并研究其具体机制。方法:RAW264.7巨噬细胞分为对照组、脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）组（LPS 500 ng/ml）,干预24小时后留取细胞上清分离外泌体;将上述两组的外泌体分别加入HL-1心肌细胞中孵育24小时。ELISA检测巨噬细胞上清中IL-6以及心肌细胞上清中IL-1β水平;RT-PCR检测巨噬细胞中IL-6、诱导型一氧化氮合酶（iducible nitric oxide synthase,i NOS）、miR-34a-5p、miR-155-5p、外泌体中miR-155-5p以及心肌细胞中miR-155-5p、NLRP3以及沉默信息调节因子1（silent mating type information regulation 3 homolog-1,sirt1）的相对表达水平;western blotting检测心肌细胞中NLRP3、半胱氨酸天冬氨酸酶1 p20亚基（caspase-1 p20）、sirt1的表达水平;免疫荧光分析巨噬细胞CD68、i NOS以及心肌细胞中caspase-1的表达情况;并通过转染si-RNA干扰sirt1表达以及转染miR-155-5p mimics、miR-155-5p inhibitor进行过表达或抑制miR-155-5p来验证它们在心肌细胞炎性小体表达激活中的作用。结果:CD68和i NOS免疫荧光双染显示LPS处理后巨噬细胞M1分化明显增加;与对照组相比,LPS组IL-6、i NOS相对水平明显升高（P＜0.01）;与对照组相比,LPS处理的巨噬细胞中miR-34a-5p和miR-155-5p均呈现出升高趋势,miR-155-5p升高更明显（P＜0.01）,且LPS处理的巨噬细胞来源的外泌体中miR-155-5p相对水平也较对照组升高（P＜0.01）。PKH26外泌体示踪分析显示巨噬细胞来源的外泌体可被心肌细胞摄取。与对照组巨噬细胞外泌体孵育的心肌细胞相比,LPS诱导的巨噬细胞来源的外泌体增加了心肌细胞中miR-155-5p的相对水平,并明显促进心肌细胞中NLRP3和caspase-1 p20的表达,增加IL-1β的分泌,但sirt1表达呈下降趋势（P＜0.05）。与si-NC组相比,sirt1干扰可增加心肌细胞中NLRP3表达和IL-1β的释放（P＜0.05）;与mimics NC组相比,miR-155-5p过表达也增加了心肌细胞中NLRP3、caspase-1表达以及IL-1β的释放（P＜0.05）,而miR-155-5p抑制可降低LPS诱导的巨噬细胞来源的外泌体对心肌细胞中NLRP3表达、IL-1β释放的促进作用以及对sirt1的抑制作用（P＜0.05）。结论:M1巨噬细胞来源的外泌体可促进心肌细胞NLRP3炎性小体的表达,其机制和miR-155-5p/sirt1通路有关。