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七氟烷是最常用的全身麻醉药物之一,多年来用于小儿麻醉的诱导和维持。大量动物研究表明,发育期大鼠暴露于七氟烷会导致广泛的海马神经元凋亡和空间学习能力严重缺陷。目前对于七氟烷诱导的神经毒性的具体机制尚未完全阐明,因而临床上迄今亦未寻找到有效的预防和治疗措施。Sanchez等研究发现吸入麻醉药会造成发育期大鼠长期的线粒体形态变异和突触传递异常,并伴有自噬活性的增强。由此推测自噬在七氟烷的神经毒性中发挥了一定的作用,也可能是重要的一环,但目前对于自噬与七氟烷神经毒性关系及神经元自噬和凋亡的关系的研究并不深入。本项目旨在探讨七氟烷诱导的新生大鼠海马组织自噬水平的改变,明确自噬在七氟烷全身麻醉过程中的作用及其相关机制以及神经元自噬和凋亡的关系,进而寻找相应的治疗靶点和最安全的临床暴露时间;由此重点进行了以下两部分的研究。第一部分利用动物模型探讨七氟烷诱导神经元自噬现象及调控的具体途径本研究将新生SD大鼠暴露于不同时间的3.4%七氟烷,通过采用免疫印迹(Western blotting)检测自噬相关蛋白 Beclin-1、LC3-Ⅱ 和 p62,QRT-PCR 检测Beclin-1mRNA、LC3mRNA和p62mRNA的表达,免疫组织化学染色和免疫荧光染色观察Beclin1、LC3和p62的表达,观察海马组织自噬水平的改变,进而探讨自噬活性与七氟烷暴露时间的关系。针对调节自噬的经典信号通路Class Ⅰ PI3K/Akt/mTOR/p70S6K及Class Ⅲ PI3K,分别使用自噬诱导剂(雷帕霉素,Rapamycin)、自噬抑制剂(3-甲基腺嘌呤,3-MA)进行干预,观察相应的自噬水平的变化。同时采用免疫印迹(Western blotting)检测凋亡相关蛋白Bax蛋白和Bcl-2蛋白水平,TUNEL法检测神经元凋亡,实验结果发现新生SD大鼠暴露于3.4%七氟烷4小时,重复3天(4hx3d)后,Western blotting检测结果显示自噬相关蛋白Beclin1和LC3蛋白水平均上调,而自噬底物p62蛋白水平下调,同时凋亡相关蛋白Bax蛋白显著上调,Bcl-2蛋白水平显著下降。QRT-PCR检测结果显示Beclin-1mRNA和LC3mRNA均上调,p62mRNA下调,免疫组织化学染色和免疫荧光染色检测结果显示Beclin-1和LC3均上调,p62下调;采用自噬激动剂雷帕霉素激活了自噬,自噬抑制剂3-MA抑制了自噬。TUNEL法检测结果显示tunnel阳性神经元细胞数显著增加。上述结果表明,七氟烷可诱导发育期SD大鼠海马神经元发生自噬,促进自噬体的形成及溶酶体和自噬体的融合。七氟烷可能通过激活Class ⅢPI3K通路或抑制mTOR来启动自噬。七氟烷在促进神经元自噬发生的同时也促进神经元凋亡的形成。自噬在七氟烷导致发育期SD大鼠海马神经元毒性的发展过程中具有非常重要的作用。第二部分利用海马神经元模型探讨七氟烷诱导神经元自噬的形成特点及其相应信号转导途径本研究将原代培养的海马神经元分别暴露于不同时间的3.4%七氟烷,通过采用Western blotting检测海马神经元内自噬相关蛋白Beclin-1、LC3-Ⅱ和p62,凋亡相关蛋白Bax蛋白和Bcl-2蛋白水平,QRT-PCR检测Beclin-1mRNA、LC3mRNA和p62mRNA的表达,免疫细胞荧光染色观察LC3的表达,RFP-GFP-LC3表达质粒瞬时转染海马神经元,监测自噬的发生,利用si RNA Knockdown Beclin-1 和 Atg5,采用 Western blotting 检测 LC3-Ⅱ 的变化,采用Annexin-V/PI检测细胞凋亡的改变。实验结果发现原代培养的海马神经元暴露于3.4%七氟烷5h后,Western blotting检测结果显示海马神经元内Beclin1和LC3均上调,而自噬底物p62下调,同时凋亡相关蛋白Bax蛋白显著上调,Bcl-2蛋白水平显著下降。QRT-PCR检测结果显示Beclin-1mRNA和LC3mRNA均上调,p62mRNA下调,免疫细胞荧光染色显示LC3水平上调;用RFP-GFP-LC3表达质粒瞬时转染海马神经元,LC3表达上调,提示自噬被激活。转染siRNABeclin-1和siRNA Atg5 后,Western blotting 检测 LC3-Ⅱ 下调,Annexin V/PI 结果显示细胞发生早期和晚期凋亡。上述结果表明,七氟烷可诱导原代培养的海马神经元发生自噬,Beclin1和Atg5调控的信号通路参与七氟烷诱导自噬的调控过程。海马神经元七氟烷暴露,不仅可以诱导海马神经元自噬,而且可以激活海马神经元发生凋亡。自噬在七氟烷导致原代海马神经元毒性的发展过程中具有非常重要的作用,综上所述,自噬可能参与七氟烷诱导的发育神经毒性,增强保护性自噬可以作为一种潜在的方式来预防七氟烷诱导的发育期神经毒性,但还需要未来进行更多的实验研究来验证。本研究为探讨自噬活性与七氟烷暴露时间的关系,为深入认识吸入麻醉药神经毒性的发病机制,进而为临床寻找其相应的治疗靶点和最安全剂量和浓度,提供一定的实验依据。