非洲菊富含脯氨酸GASA类蛋白基因PRGL的克隆与表达

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植物细胞壁蛋白在细胞壁结构、代谢、细胞生长、信号、对生物与非生物胁迫的响应以及许多其它生理过程中起着至关重要的作用,同时赤霉素(GAs)参与控制植物发育的许多过程,如茎的伸长、叶的扩展以及花和果的发育等。本课题从研究调控非洲菊花瓣生长的功能基因入手,从非洲菊早期花瓣中分离GASA同源基因,通过研究该基因的表达模式、对植物激素和外界环境因子的响应以及转基因植株表型特征分析来阐明该基因产物的功能。 通过RACE技术从非洲菊P2(stage 2)花瓣中获得了一个GASA同源基因PRGL(Prolme rich GASA-like),该基因推导的蛋白产物含有150个氨基酸,分子量为15.9 kD:含23.3%的脯氨酸,8.6%的半胱氨酸和10.0%的赖氨酸。其蛋白质序列包含了三个明显的结构域:N-端的19个氨基酸残基组成了一个信号肽;其后是一个富含脯氨酸的结构域,该区域含有5个PPVXK基序拷贝,这样的重复序列与SbPRP和AtPRP1中的类似;C-端的60个氨基酸残基组成了一个典型的GASA结构域,其中含有12个具保守位置的半胱氨酸。 可切割的N-端信号肽以及PRGL-EGFP融合表达载体在洋葱表皮细胞瞬时表达的结果表明,PRGL的N-端信号肽引导蛋白产物分泌到细胞壁中去,PRGL是一种细胞壁蛋白。此外,对细胞壁蛋白组分的Western blot分析结果表明,PRGL可能与细胞壁中多糖基质的结合较为牢固。 Nothern blot分析结果表明,PRGL不仅在花中表达,而且在叶和根中也有表达。但该基因在各器官中的表达都只是局限于幼嫩部分。非洲菊的花序由花梗、花托、苞叶、舌状花和盘状花几个部分组成。在花序发育过程中其各部分器官有着不同的生长速度,其中花梗、舌状花和盘状花长度从P1到P3有很高的生长速度,在随后的P3到P6则生长速度锐减,对于花序的另外两个器官花托和苞叶则在P1到P6期间一直处于很低的生长水平。对P2花序各器官中PRGL基因表达检测结果显示,处于快速生长状态的花梗、舌状花和盘状花有较高的PRGL的表达水平,而生长缓慢的苞叶和花托则几乎检测不到该基因的表达。从PRGL的时空表达模式特征,我们可以推测PRGL可能与非洲菊一些幼嫩器官的快速生长有关。 大多数GASA基因的表达是受GAs上调的。非洲菊离体培养实验结果表明,外加20μmol/L GA3可以明显促进舌状花花瓣的伸长,而且Nonhern blot分析结果显示,非洲菊P2花序离体后PRGL表达水平显著下降,但是在3%蔗糖溶液中添加外源GA3可使舌状花花瓣中PRGL高表达时间明显延长。结果表明,PRGL的表达依赖于GA的存在并与花瓣的伸长保持相关性。 许多PRPs基因的表达都会对各种生物和非生物胁迫做出响应,因此人们认为这些蛋白可能与伤口愈合及植物的防御有关。根据叶片展开的程度以及叶片的大小,把非洲菊叶的生长发育分为5个时期,PRGL只是在P1-P3期叶片中有表达。伤害处理P3期叶片可以显著促进PRGL基因的表达,因此PRGL可能如其它PRPs一样参与了植物的防御过程。 将PRGL基因异源转化拟南芥,对超表达PRGL转化植株进行初步表型分析。结果表明:在正常的MS培养基中,PRGL超表达幼苗并未表现出明显的表型特征,但若是在含10μmol/L PAC的MS培养基中,与野生型拟南芥相比,转PRGL拟南芥则具有叶片较大且能展开等特征。PAC是GAs生物合成抑制剂,通过降低植物体内的GAs水平,使植物体中许多依赖于活性GAs的基因不能表达或表达量极低,导致植物生长的严重障碍。PRGL超表达拟南芥的表型特征表明,PRGL可能参与了GA介导的植物生长过程。 综上所述,在非洲菊花瓣中克隆的PRGL基因编码一个同时具有PRP和GASA结构域的细胞壁蛋白。PRGL的表达具有发育的时空性,并且GA3和伤害均可诱导该基因的表达。推测PRGL与非洲菊的快速生长及胁迫响应相关。
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