膝关节前交叉韧带(anterior cruciate ligament, ACL)损伤是临床常见的严重运动损伤。ACL具有限制胫骨向前过度移动的重要功能,其损伤后可发生膝关节不稳定,从而可造成患者运动能力显著下降,影响其日常生活,并可继发软骨损伤和骨关节炎。美国每年有40万ACL损伤病例,相关治疗费用达70亿美元。我国运动员ACL损伤的患病率为0.5%-10.5%,随着全民健身运动和竞技体育的发展,ACL损伤的发病率逐年呈明显上升趋势。ACL重建移植物包括自体、异体韧带或肌腱和人工韧带。自体移植物最常用,但存在供区病损和ACL重建翻修术移植物来源缺乏等问题。异体移植物无供区病变,但其愈合时间长,力学强度仅为自体的70%,一年内的失败率可达13%,并可能传播疾病和引起免疫排斥。由于自体和异体移植物重建ACL都存在一些弊端,寻找更理想的韧带移植物,一直是骨科和运动医学领域研究的热点。理想的人工韧带应满足以下要求：良好的生物相容性,能促进自体组织愈合与再生；仿生学设计,力学性能优良,术后患者可以早期恢复运动。目前临床应用比较广泛的人工韧带只有法国研制的LARS人工韧带,它采用已用于临床手术缝线和人造血管的聚对苯二甲酸乙二醇酯(polyethylene terephthalate, PET)材料。2010年,我科研究报道了LARS人工韧带植入术后3-5年的多中心研究,结果显示93%以上的患者疗效满意,功能恢复：另外,仍有5.7%的失败率,其中包括挤压螺钉松动、移植物-骨愈合不佳、滑膜炎等。因此,如何提高PET韧带与骨隧道的愈合能力,诱导自体骨组织长入,使PET韧带与骨组织形成稳定的接合,并大幅度提高PET重建ACL手术的成功率和术后疗效,成为我们的研究目的。羟丙基纤维素(Hydroxypropylcellulose, HPC)是一种以天然纤维素为原料经化学改性制得的半合成型高分子聚合物,属于非离子型纤维素醚。HPC无臭、无味、无毒,呈白色粉末状,溶于水,对光热均稳定。因HPC与许多阴离子、阳离子、非离子及其两性表面活性剂具有良好的相容性,与其他聚合物具有良好的溶解性、生物相容性和生物降解性,被广泛应用于食品、制药、化妆品、石油化工等领域。本课题用HPC涂层处理PET人工韧带,以期处理过的PET人工韧带能够有更好的生物相容性,能够促进PET韧带与骨的愈合,从而提高PET人工韧带移植的成功率。我们在Wistar大鼠骨髓基质细胞(BMSCs)、ACL成纤维细胞及滑膜细胞RSC-364中验证HPC涂层对细胞相容性及成骨分化的影响。随后在新西兰大白兔关节外腱-骨愈合模型初步验证HPC涂层处理的PET移植物可否促进移植物-骨愈合。此外,为了利用比格犬关节内ACL重建模型来进一步验证HPC涂层的作用,本课题成功制备了适合比格犬ACL重建的PET人工韧带,且其生物力学性能良好,基本适合用于比格犬的动物实验。最后为了克服目前LARS人工韧带的缺点,打破其在国内的垄断并降低人工韧带的成本,我们对人工韧带进行形态结构的设计改造,旨在设计处新型国产化的悬吊式人工韧带。为进一步研究腱(移植物)-骨愈合奠定良好的实验基础。第一部分羟丙基纤维素涂层-PET复合材料对体外细胞相容性及成骨分化影响的实验摘要目的：在体外观察并比较羟丙基纤维素(Hydroxypropylcellulose, HPC)-PET复合材料(HPC/PET组)与未经处理的PET材料(PET组)对骨髓基质干细胞(BMSCs)、前交叉韧带(ACL)成纤维细胞及RSC-364滑膜细胞相容性及成骨分化的影响。方法：将HPC-PET复合材料及PET纤维置于24孔培养板中,分别都加入BMSCs、ACL成纤维细胞及RSC-364细胞悬液(密度2×104/m1)。通过CCK-8细胞计数法于细胞培养第1d、2d、4d、6d、8d和10d时,检测HPC涂层对BMSCs细胞、ACL成纤维细胞及RSC-364细胞增殖活性的影响。Western blotting法于细胞培养第7天时检测BMSCs细胞、成纤维细胞及RSC-364细胞中Integrin-β1的蛋白含量,以此观察HPC涂层对细胞粘附性的影响。培养7天后对BMSCs、ACL成纤维细胞及RSC-364细胞行扫描电镜(SEM),以观察HPC/PET组与PET组中细胞形态的变化。ELISA法于培养第5d、7d、10d、14d时检测BMSCs细胞中碱性磷酸酶(ALP)活性和Osteopontin的蛋白表达量,以及Western blotting法于培养第7d时检测BMSCs细胞中BMP-2和BMP-7的蛋白含量,以此观察HPC涂层对BMSCs细胞的成骨分化能力。结果：SEM分析显示经HPC涂层修饰后,PET纤维表面覆盖了一薄层涂层。傅立叶红外光谱分析显示相比于单纯PET材料,HPC/PET材料在3600-3200cm-1处出现了HPC羟基的伸缩振动及3011-2819cm-1处出现HPC中的C-H伸缩振动。CCK-8法检测BMSCs细胞的增殖活性发现,HPC/PET组的细胞增殖在培养6天,8天及10天时的吸光度A450nm值均高于PET组(P值均<0.05)。CCK-8法检测ACL成纤维细胞的增殖活性结果显示,HPC/PET组的细胞增殖在培养4天时,6天,8天,10天时的吸光度A450 nm值高于PET组(P值均<0.05)。CCK-8法检测RSC-364细胞的增殖活性发现,HPC/PET组的细胞增殖在培养8天、10天时的吸光度A450 nm值均高于PET组(P值均<0.05)。SEM观察发现PET组中无BMSCs、成纤维细胞和RSC-364细胞在PET纤维表面的粘附,而HPC/PET组中的3种细胞的粘附伸展均良好,细胞立体感较强,表现出一个多边形的形态,且细胞间的突触联系较多。Western blotting分析结果显示：培养7天时3种细胞中Integrin-β1在HPC/PET组中的表达量显著高于在PET组中的表达(P值均<0.01)。ELISA法检测显示,BMSCs培养5天,7天时,10天和14天时ALP的活性在HPC/PET组高于在PET组中(P值均<0.05)。BMSCs培养7天,10天和14天时HPC/PET组中Osteopontin的表达量高于在PET组(P值均<0.05)。而培养7天时BMSCs细胞中BMP-2和BMP-7在HPC/PET组中的表达量均显著高于在PET组中的表达(P值均<0.01)。结论：HPC-PET复合材料未表现出对细胞的毒性,且还能明显提高体外BMSCs、成纤维细胞及RSC-364滑膜细胞的细胞相容性及成骨分化能力。HPC涂层对BMSCs细胞的成骨分化能力。第二部分羟丙基纤维素涂层对PET移植物在兔关节外模型中与骨愈合影响的实验摘要目的：探讨羟丙基纤维素(hydroxypropylcellulose, HPC)涂层是否能加强PET人工韧带移植物与骨道愈合。方法：本研究采用30只新西兰大白兔,采用关节外腱-骨愈合模型将人工韧带植入胫骨近端。一侧肢体以植入HPC涂层韧带为实验组,对侧肢体植入非HPC涂层韧带为空白组。兔子在4周及8周处死,分别进行生物力学,组织学和real time-PCR基因测试。结果：术后4周和8周时,生物力学测试所有组织标本均可被完全拉出骨隧道,无韧带断裂发生。术后4周时HPC涂层组与对照组之间的最大拉力统计学上无显著性差异(P=0.328)。术后8周时HPC涂层组的最大拉力明显高于对照组(P<0.001)。同样,术后4周时HPC涂层组与对照组之间的刚度结果在统计学上无显著性差异(P=0.128)。术后8周时,HPC涂层组的刚度高于对照组(P=0.018)。术后4周时较厚的纤维样组织出现在对照组及HPC涂层组的移植物-骨界面。术后4周时在HPC涂层组中发现一些纤维组织穿插进入人工韧带。术后8周时,HPC涂层组中发现移植物-骨界面上有大量突出的新骨形成；此外,移植物-骨界面相对较窄,疤痕组织较少,部分界面组织长入PET移植物内,并与移植物PET纤维相交织。而对照组中仅见较厚的纤维疤痕组织存在于移植物-骨界面中,无新骨形成。组织形态学分析显示,术后8周时HPC涂层组的界面宽度显著狭窄于对照组(P<0.001)。术后4周时,HPC涂层组中BMP-2和Osteopontin的mRNA表达水平高于它们在对照组中的表达水平(P值均<0.05)。术后8周时,BMP-2在HPC涂层组中的mRNA表达水平高于它在对照组中的表达水平(P=0.010)。结论：本研究表明人工韧带表面HPC涂层能够有效地促进人工韧带骨隧道内移植物与骨愈合。层韧带为空白组。兔子在4周及8周处死,分别进行生物力学,组织学和real time-PCR基因测试。第三部分比格犬尺寸的PET人工韧带的制备及生物力学性能检测的实验摘要目的：制备出一种比格犬尺寸的PET人工韧带用以比格犬ACL重建,并对其进行生物力学的测试。方法：对LARS人工韧带的结构及组织进行分析,利用企业现有设备,进行了工艺调整,试织了一种织物结构。对在不同工艺条件下织造的基布进行了拉伸性能测试。采用不同的清洗方案对PET人工韧带织物试样进行清洗,同时设定空白组。观察各组中细胞生长状况。对人工韧带半成品进行缝制,并最终缝合处比格犬尺寸的PET人工韧带成品。检测比格犬尺寸的PET人工韧带的力学性能,包括拉伸强力测试、静态蠕变测试(疲劳性能测试)及空隙率测试等。结果：试织的织物纵密为17圈/cm时,其断裂强力、理论强力、强力损失率最高,而其断裂伸长率最低。各组细胞生长状况均较为良好,其中3#清洗方法细胞生长最佳(P<0.01)。比格犬尺寸PET人工韧带拉伸强力为2959.53±7.25N,最大伸长量为12.43±0.95mm,最大伸长率为13.8±1.06%。比格犬尺寸PET人工韧带体的静态蠕变为恢复24小时后最终伸长率为0.16%,而LARS人工韧带的恢复24小时后最终伸长率<1.5%。清洗前后比格犬尺寸PET人工韧带织物的孔隙率差异无统计学意义(P=0.880)。结论：成功制备了适合比格犬ACL重建的PET人工韧带,且其生物力学性能良好,基本适合用于比格犬动物实验。比格犬尺寸的PET人工韧带成品。检测比格犬尺寸的PET人工韧带的力学性能,包括拉伸强力测试、静态蠕变测试(疲劳性能测试)及空隙率测试等。第四部分羟丙基纤维素涂层-PET人工韧带用于比格犬前交叉韧带重建的实验研究摘要目的：探讨羟丙基纤维素(hydroxypropylcellulose, HPC)涂层的PET人工韧带重建比格犬ACL是否能加强PET人工韧带移植物与骨道的愈合。方法：本研究选取24只成年雄性比格犬,使用HPC涂层的PET人工韧带(HPC组)和无HPC涂层的PET人工韧带(对照组)植入比格犬左侧膝关节内进行ACL重建。术后4周及16周处死动物,获得股骨-PET人工韧带移植物-胫骨复合物。对此复合物进行生物力学,组织学和分子生物学检测。结果：术后4周和16周时,所有PET人工韧带均可被完全拉出骨隧道,无PET人工韧带断裂发生。术后4周时HPC涂层组中骨隧道内人工韧带-骨的最大拉力高于对照组(P=0.010)；而术后16周时HPC涂层组的最大拉力显著高于对照组(P=0.001)。术后16周时HPC涂层组的刚度高于对照组(P=0.020)。术后4周时,在对照组中仅发现少量胶原纤维形成,而HPC涂层组中发现较多胶原纤维形成并长入移植物内。术后16周时对照组中仅见胶原纤维形成数量有所增加,无新骨形成,而HPC涂层组中发现移植物-骨界面上有突出的新骨形成,并包绕移植物PET纤维。术后4周时BMP-7和TGF-β1在HPC涂层组中的mRNA表达水平显著高于它们在对照组中的表达水平(P值均<0.01)；COL3和VEGF在HPC涂层组中的mRNA表达水平高于在对照组中的表达水平(P值均<0.05)。术后16周时COL3、Osteocalcin和RUNX2在HPC涂层组中的mRNA表达水平高于在对照组中的表达水平(P值均<0.05)。术后4周时,HPC涂层-PET人工韧带组内有薄层滑膜组织覆盖于关节腔内的人工韧带自由纤维部,而对照组内可见较为明显的软组织覆盖于关节腔内的人工韧带自由纤维部。术后4个月时,HPC涂层-PET人工韧带组内有厚层滑膜组织覆盖于关节腔内的人工韧带自由纤维部,而在对照组内仍仅有少量滑膜组织覆盖于关节腔内的人工韧带自由纤维部。免疫组化检测关节腔内人工韧带自由纤维部分中COL1的结果显示,术后4周和16周时,HPC组中COL1的表达量均显著大于对照组(P值均<0.01)。结论：本研究表明PET人工韧带表面HPC涂层能够有效地促进PET人工韧带与骨隧道的愈合。第五部分新型悬吊式人工韧带的外观及结构设计为了克服现有LARS人工韧带固定方式所存在的缺陷,本研究已完成几种新型悬吊式人工韧带的设计,并已获得相关实用新型专利的授权。新型悬吊式人工韧带的环袢可与纽扣钢板(Endobutton)相连接,不仅实用方便、减少手术时间,提高了生物力学强度；最为重要的是避免了使用挤压螺钉对骨道的挤压及韧带多孔表面结构的挤压,这样更有利于韧带结构与骨隧道的紧密贴合,增加骨组织长入韧带多孔间隙的机会,从而有利于骨组织长入人工韧带内,最终促进移植物与骨的愈合。