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木糖作为木质纤维素水解产物中除葡萄糖外含量最为丰富的可发酵糖,利用其生产乙醇对于缓解石油枯竭的能源危机具有重要意义,乙醇生产菌株酿酒酵母无法直接利用木糖,引入木糖代谢相关基因构建木糖代谢途径是实现以木质纤维素为原料的生物质乙醇发酵生产方法之一,如何构建高效的木糖代谢途径是急需解决的关键问题。本课题利用来自产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes)的渗透压调控启动子及其受调控的木糖醇脱氢酶(XDH)基因XYL2,在酿酒酵母中进行差异表达,旨在提高XDH酶活力从而降低副产物木糖醇的积累,促进木糖消耗和乙醇合成。克隆获得产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes)中的木糖还原酶(XR)基因XYL1和木糖醇脱氢酶基因XYL2,以及酿酒酵母自身的木酮糖激酶(XK)基因XKS1,基于代谢途径催化酶比例关系,通过在高拷贝质粒pYX212上表达XYL2基因,在低拷贝质粒p414上表达XYL1和XKS1基因实现差异表达,构建木糖代谢重组菌。所构建的重组菌中XR:XDH:XK酶活比值约为1:5:4,以木糖为单一碳源时,重组菌在72 h内可消耗8.59 g·L-1木糖,生成2.58 g·L-1乙醇,但木糖醇积累量达到4.30 g·L-1,表明XDH酶活力不足仍是抑制木糖消耗且积累木糖醇的主要原因。同时,通过以不同辅酶对XR和XDH酶活力进行测定发现,XR为双辅酶偏好,其对NADPH的偏好性约为对NADH的5倍,XDH严格依赖于NAD+。为提高木糖醇脱氢酶基因XYL2的表达水平,本研究利用C.glycerinogenes的渗透压调控强启动子PCgSTL3、PCgZWF和PCgGPD,替换载体pYX212上PTPI启动子表达XYL2基因,调节培养基的渗透压从而提高XDH酶活力。对重组菌中XYL2基因转录水平和XDH酶活力在不同渗透压培养基中进行测定发现,以PCgGPD为启动子的重组菌受渗透压调控最为敏感,在含有100 g·L-1木糖的培养基中,XYL2基因转录水平增加了3.5倍,XDH酶活力提高了1.7倍;在添加了0.4 mol·L-1 NaCl的YEPX培养基中,其转录水平增加了4.8倍,XDH酶活力提高了2.8倍,这为木糖醇脱氢酶的高表达提供了新方法。对渗透压调控重组酿酒酵母的木糖和混合糖发酵性能进行了分析发现:与参照相比,以PCgGPD为启动子的重组菌在0.4 mol·L-1 NaCl调控下以木糖为单一碳源时可在72 h内完全消耗20 g·L-1木糖,乙醇产量从5.65 g·L-1增加至7.95 g·L-1,木糖-乙醇转化率达到0.40 g·g-1,木糖醇产率降低了52.0%;渗透压调节下以葡萄糖和木糖为混合碳源时与参照相比,木糖消耗量提高了62.3%,木糖-乙醇转化率由0.31 g·g-1提高至0.34 g·g-1。研究表明,渗透压调控启动子PCgGPD在NaCl调节下可显著增强木糖醇脱氢酶活力,促进木糖消耗的同时有效降低木糖醇积累,提高乙醇产率,为进一步构建高效的纤维素乙醇生产菌株提供了有利参考。