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水牛是我国南方地区的一种极具开发潜力的乳肉役兼用大家畜,但因其产奶性能较差,急需进行改良。通过体细胞克隆技术,可对良种水牛个体进行复制,迅速提高水牛种群的生产性能。然而,目前水牛体细胞克隆的效率较低,尚无法作为常规繁殖技术应用于生产实践。越来越多的研究表明,来自不同个体体细胞的克隆效率存在明显差异,筛选克隆效率高的动物个体是提高克隆效率的有效途径之一。本实验室的研究也发现,水牛体细胞克隆的效率也存在类似现象。如能弄清导致这种差异的分子机制,将有望通过人为调控水牛体细胞重编程的过程,精确筛选克隆效率高的水牛个体,大大提高水牛体细胞的克隆效率。为此,本研究将系统研究不同克隆效率水牛供体细胞系的细胞超微结构、表观遗传修饰状态和能量代谢等生物学特性,检测分析与克隆效率相关的因素,探寻与克隆效率相关的生理特征,以便深入认识水牛体细胞克隆效率差异的机制,为精确筛选克隆效率高的水牛个体、调控体细胞重编程效率和提高水牛体细胞克隆效率奠定理论基础。研究取得如下结果:1.来自不同水牛个体供体细胞系的生物学特性与克隆效率采用组织块培养法培养、获得了来自4头水牛胎儿的4个成纤维细胞系（命名为BFF1、BFF2、BFF3、BFF4）。这4个细胞系的增殖速度有差异,BFF2的增殖速度较快,但差异不显著（P>0.05）;不同个体来源细胞凋亡率有显著性差异（P<0.05）,BFF1的凋亡率显著高于其它细胞系,但细胞系之间的染色体稳定性无显著性差异（P>0.05）。以BFF2,BFF3为供体的克隆胚胎囊胚发育率显著高于来源于BFF1,BFF4的克隆胚胎（P<0.05）。2.来自不同水牛个体细胞系的超微结构、表观遗传修饰和生理代谢状态对4个细胞系的超微结构、表观遗传修饰和生理代谢状态的检测,分析发现:（1）克隆效率高的细胞系BFF2和BFF3的核内异染色质较少,线粒体数量较少,核仁较大,而克隆效率低的两组细胞则与之相反。（2）BFF2和BFF3异染色质蛋白HP1a表达水平低于另外两组,且BFF2中异染色质松弛因子Gadd45a的表达水平最高。（3）BFF2 DNA甲基化水平（5mC）较低,羟甲基化修饰（5hmC）水平较高,H3K9me3修饰水平较低,但差异不显著（P>0.05）;BFF2和BFF3的H3K9ac修饰水平显著高于克隆效率低的BFF1和BFF4（P<0.05）。（4）克隆效率高的BFF2和BFF3代谢旺盛,耗氧速率和产酸速率的都显著高于克隆效率低的BFF1和BFF4,其中BFF2的糖酵解代谢最旺盛。3.克隆效率差异显著的水牛供体细胞H3K9三甲基化、乙酰化修饰位点的筛选和分析对两个克隆效率差异显著的水牛胎儿成纤维细胞系（BFF1、BFF2）ChIP-seq检测分析发现,BFF1特有H3K9me3修饰位点基因358个、H3K9ac修饰位点基因4864个,BFF2特有H3K9me3修饰位点基因13个、H3K9ac修饰位点基因137个。对H3K9me3修饰差异位点的GO聚类分析发现,BFF1识别到特有的差异基因与代谢过程关系最密切,而BFF2中特有的差异基因与线粒体功能相关基因关系最密切。对H3K9ac修饰差异位点的GO聚类分析发现,两个样本的差异基因都与代谢过程关系最密切,其中H3K9ac调控BFF1的糖酵解负相关基因,而H3K9ac调控BFF2的糖酵解、ATP活性等相关基因。对修饰位点差异显著的相关基因KEGG功能富集分析发现,H3K9me3修饰位点差异显著的是一类与多糖降解相关的基因;H3K9ac修饰位点差异最显著的基因是一类参与代谢通路调控的基因。4.细胞的葡萄糖代谢途径与组蛋白乙酰化修饰水平的相关性水牛供体细胞经糖酵解抑制剂2-脱氧葡萄糖（5 mM）培养处理48 h后,细胞内异染色质增多,核仁变小,线粒体的数量增加,H3K9ac的修饰水平下调。当在培养液中的添加5 mM葡萄糖时,细胞的H3K9ac修饰水平上升。不同克隆效率供体细胞的糖酵解相关酶活性、相关基因的表达水平和细胞内糖酵解代谢产物的浓度检测发现,较高克隆效率BFF2的GAPDH和LDH酶活性显著高于其他细胞系,促进糖酵解相关基因的表达水平较高,细胞内乳酸和乙酰辅酶A（acetyl-CoA）的浓度也存在显著差异。当在培养液中分别添加乳酸或acetyl-CoA培养BFF1时,40 mM的乳酸显著提高细胞的H3K9ac修饰水平,降低染色质的致密性;添加PS48使细胞增殖速度变快,促进乳酸的生成,提高H3K9ac修饰水平。去乙酰化酶的检测分析发现,克隆效率较高供体细胞（BFF2、BFF3）的去乙酰化酶活性低于克隆效率较低的供体细胞（BFF1、BFF4）;添加PS48或者乳酸可以显著降低BFF1的去乙酰化酶活性。5.组蛋白去乙酰化抑制剂（TSA、Scriptaid）对水牛体细胞克隆效率的影响供体细胞经30 nM TSA或500 nM Scriptaid培养处理后,其随后核移植的克隆胚胎分裂率（79.1%,72.3%vs 55.9%,P<0.05）和囊胚率（30.8%,26.6%vs 18.4%,P<0.05）均显著高于对照组。进一步的检测分析发现,TSA或Scriptaid处理导致BFFs的超微结构、增殖、代谢和H3K9ac修饰等特性发生如下变化:（1）核内异染色质明显变少,核仁变大,线粒体的数量也减少;细胞的HP1a表达水平下调,异染色质松弛因子Gadd45a表达上调。（2）细胞的ATP产量减少,糖酵解代谢增强。（3）细胞内乳酸产量升高,去乙酰化酶活性被明显抑制,细胞的H3K9ac修饰水平显著提高。上述结果表明:来自不同水牛个体的体细胞克隆效率存在明显差异,这种差异是由于其能量代谢途径不同,进而导致其表观遗传修饰和染色质结构差异所致;克隆效率高的供体细胞,其核内异染色质较少,核仁较大,线粒体数较少,能量代谢较旺盛,H3K9ac修饰水平较高,DNA甲基化和H3K9me3甲基化修饰水平较低,特有的H3K9me3和H3K9ac修饰位点基因较少;增强细胞的葡萄糖酵解代谢途径或添加其代谢中间产物乳酸,可以提高细胞的组蛋白乙酰化修饰水平,使染色质构型趋向松散状态;TSA和Scriptaid亦可通过促进细胞的糖酵解代谢途径,提高H3K9ac的修饰水平,进而提高其克隆胚胎的发育潜能。