背景龋病是影响口腔健康的常见疾病,被世界卫生组织列为继癌症、心血管疾病之后的第三大慢性非传染性疾病。现代病因学研究强调,细菌是影响龋病形成和发展的主要因素,它们以菌斑生物膜的形式在牙表面聚集,通过生长代谢活动,改变局部微环境条件,造成牙体硬组织损伤。防治龋病的关键在于控制菌斑。目前控制菌斑的主要方法有机械去除法和抗菌药物的应用,二者在临床上常结合使用。机械去除法尽管有效,却很难长期维持菌斑控制的理想水平,对于一些隐蔽的牙面,如较深的窝沟、邻面,常常无法达到到满意的效果。抗菌药物的长期使用,不仅会产生细菌耐药性,还会引起菌群失调,在宿主免疫力减弱时,增加机会性感染的可能性。光动力学疗法(photodynamic therapy,PDT)是无创或微创性、非产热性的、利用光激活光敏剂产生光化学效应选择性杀伤病原微生物的一种新方法,主要涉及光敏剂、光源和氧分子。研究表明,光敏剂和激光单独作用时对口腔内各种微生物没有影响,然而当合适的光敏剂,与光结合应用,产生的光敏效应能够抑制多种病原菌生长,而且不会产生耐药性,这显示了其相对于抗菌药物的优越性。此外,光敏剂利用注射器很容易涂布于各个牙面或龋损部位,然后合适的光源通过光纤递送,操作简单方便。综合大量国外学者的研究,发现光动力学疗法有望成为一种新的控制菌斑和预防龋病的方法。目前国内尚未见到光动力学疗法在龋病防治领域的研究报道,而国外大量基础研究仅局限于浮游状态下的细菌或单细菌生物膜,对多细菌菌斑生物膜的影响作用报道甚少。因此要建立适合龋病防治的光动力学治疗系统还有待大量的深入研究。目的本研究主要观察甲苯胺蓝介导的光动力学疗法对口腔主要致龋菌的生长抑制作用,探索适宜的光动力学疗法治疗参数;同时建立人工多细菌菌斑生物膜体外模型,观察光动力学疗法对菌斑生物膜形成及形态的影响,为开发龋病防治新方法提供初步实验依据。方法1.光敏剂甲苯胺蓝吸收光谱的测定。配置不同浓度的甲苯胺蓝溶液,测定甲苯胺蓝在波长范围为500nm-700nm区间内的吸收光谱,观察不同浓度对其吸收峰值的影响。在此基础上寻找合适的光源,以达到光动力学疗法的最佳效果。2.甲苯胺蓝抑制四种口腔常见致龋菌体外生长的实验研究。以4种口腔常见致龋菌为研究对象,用液体稀释法检测甲苯胺蓝对各菌种的最小杀菌浓度(MBC)。3.光动力学疗法抑制变形链球菌体外生长的实验研究。观察变形链球菌在不同光照时间和光敏剂浓度下经光动力学疗法处理后的生长情况,平板菌落计数法计算活菌数,扫描电镜观察光动力学疗法处理前后变形链球菌菌体形态的改变。4.体外环境下,选择变形链球菌、远缘链球菌、粘性放线菌和嗜酸乳杆菌四种口腔主要致龋菌在牙釉质表面形成多细菌混合菌斑生物膜,用光动力学疗法处理实验组菌斑生物膜(参数:光敏剂浓度为100μg/ml、光强为94.5J/cm2),分别在生物膜形成的第1天,3天、7天用扫描电镜观察生物膜形态。结果1.甲苯胺蓝溶液的吸光度值随着其浓度的增加而逐渐增加。甲苯胺蓝溶液浓度为25μg/ml、50μg/ml和100μg/ml时最大吸收峰值分别在波长为635nm、635nm和620nm处。溶液浓度的改变对甲苯胺蓝的吸收峰值有一定的影响。2.高浓度的甲苯胺蓝有一定的抑菌作用。当甲苯胺蓝浓度为1000μg/ml时,四种细菌无一生长。甲苯胺蓝对变形链球菌、远缘链球菌、嗜酸乳杆菌和粘性放线菌的MBC分别为500-1000μg/ml、500-1000μg/ml、250-500μg/ml、125-250μg/ml。3.单独的光对照组和甲苯胺蓝对照组对变形链球菌的灭菌效果不理想,与空白对照组相比,各组间无显著性差异(P﹥0.05),光动力实验组各组与空白对照组相比有显著性差异(P<0.05)。当光敏剂浓度≤50μg/ml时,同一浓度段不同光照时间段各组间无显著性差异(P﹥0.05)。当光敏剂浓度为100μg/ml时,不同照射时间的各实验组间有显著性差异( P<0.001)。光敏剂浓度和光剂量对变形链球菌的生长抑制作用存在交互作用(F=19.47, P<0.01)。4.扫描电镜图片结果显示:在20,000倍扫描电镜图下观察,空白对照组变形链球菌菌体外形清晰,菌细胞表面光滑连续、无缺损。光动力学疗法处理组菌体外形清晰,但大部分菌细胞表面粗糙不平,有水泡状凸起,菌细胞周围有散在的不定形物质溢出。提示光动力学疗法对变形链球菌细胞形态有明显影响。5.扫描电镜下可观察到多细菌混合菌斑生物膜的形成过程:在未做光动力学处理的对照组中,第1天可见到以链球菌为主的细菌粘附于获得性膜上,细菌之间有聚集成团的趋势。菌斑生物膜形成的第3天细菌量明显增多,可看到杆菌和放线菌被链球菌包裹缠绕,形成谷穗状结构,细菌之间存在较多不定形胶状物。至第7天时,细菌数量与堆积厚度进一步增加,生物膜形成更为复杂的三维立体结构,细菌表面及细菌之间可见大量基质,将细菌连接成大片菌斑。但在生物膜形成的第1,3,7天,实验组菌斑生物膜的厚度均明显小于对照组,细菌之间的粘附也相对疏松,较少见到基质和不定形胶状物。结论1.甲苯胺蓝溶液的吸收峰值在620nm-635nm之间,最大吸收峰值与浓度有关,随着浓度的增加,其吸收光谱明显向短波长处位移。2.高浓度甲苯胺蓝有一定的抑菌作用。甲苯胺蓝对变形链球菌、远缘链球菌、嗜酸乳杆菌和粘性放线菌的MBC分别为500-1000μg/ml、500-1000μg/ml、250-500μg/ml、125-250μg/ml。3.单独的光对照组和甲苯胺蓝对照组对变形链球菌的灭菌效果不理想,光动力实验组各组与空白对照组相比各组间有统计学差异,光敏剂浓度和光剂量对变形链球菌的生长抑制作用存在交互作用。4.光动力学疗法处理后,变形链球菌菌体形态发生明显改变。菌细胞表面粗糙不平,有水泡状凸起,菌体周围有散在的不定形物质溢出。5.光动力学疗法可以抑制菌斑生物膜的形成。在生物膜形成的第1,3,7天,实验组菌斑生物膜的厚度均明显小于对照组,细菌之间的粘附也相对疏松,较少见到基质和不定形胶状物。