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脱落酸(abscisicacid,ABA)是一种重要的植物激素，除植物外，已经报道有很多真菌也可以生物合成。灰葡萄孢霉（Botrytiscinerea）发酵生产ABA已经工业化。但有关真菌中ABA合成途径和分子机理方面的研究还非常少，这严重制约了真菌发酵ABA产量的进一步提高和ABA的大规模应用。本论文应用比较组学的方法，比较了B.cinereaTB-3-H8菌株在不同发酵代谢调控条件下生产ABA时各种基因在转录水平上的差异。同时比较分析了ABA合成基因簇中相关基因bcaba1-bcaba4在B.cinereaTB-3-H8菌株及其他已报道菌株中的差异。进一步研究了B.cinereaTB-3-H8中bcaba1-bcaba4在高产代谢调控下，不同发酵时间点的表达情况。对不同发酵代谢调控条件下ABA合成相关基因的表达获得了初步整体的认识。为阐述B.cinereaABA合成的分子机理及完善B.cinereaABA代谢调控网络提供了依据。
论文主要包括以下三章的内容与结果。
第一章:不同发酵代谢调控条件下ABA高产菌株B.cinereaTB-3-H8中基因差异表达研究
应用扩增片段长度多态性(cDNA-amplifiedfragmentlengthpolymorphism，cDNA-AFLP)研究了ABA高产与低产发酵代谢调控条件下的差异表达基因。比较了3个不同发酵代谢调控条件下样品中的基因在转录水平的差异。通过256对选择扩增引物组合的AFLP分析，一共获得856个差异表达片段。对其中的45个在ABA高产发酵代谢调控条件下明显上调的差异表达片段进行了测序和生物信息学分析。经过BlastX分析发现31个差异表达片段与已知功能的蛋白的编码基因具有较高相似性。根据GeneOntology(GO)中描述的分子功能，这31个蛋白分为以下几类:具有催化活性的酶，具有转录调控因子活性的蛋白，具有转运功能的蛋白等。并对这些蛋白及其参与或者调控生物过程进行了综合分析，初步建立了一个简单的ABA合成调控的网络模型。并应用qPCR（PolymeraseChainReaction）技术研究了其中五个差异表达基因在高产代谢调控条件下不同时间点的表达情况。这五个基因分别编码奥尔多还原酶(aldo-ketoreductase)、6-磷酸葡萄糖酸内酯酶(6-phosphogluconolactonase),cytochromeP450alkanehydroxylase(P450烷基羟化酶)，2OG-Fe(Ⅱ)氧化酶家族氧化还原酶(2OG-Fe(Ⅱ)oxygenasefamilyoxidoreductase)和NADH氧化酶(NADHoxidase)。研究发现四个基因在ABA大量合成阶段长时间(65-192h)维持较高的表达的水平（2-8倍）。进一步克隆了这五个基因的全长编码序列，与B.cinereaB05.10（不合成ABA）的对应序列进行了比对方分析，共发现了42个碱基的差异。本文首次利用cDNA-AFLP的研究方法结合不同的发酵代谢调控条件筛选到了31个在ABA高产时期高表达基因，对五个明显上调基因表达研究，发现其中4个基因的表达与ABA的合成密切相关。该研究为揭示B.cinerea中ABA合成的分子机理，探索菌种选育新方法提供了参考，同时也为完善B.cinereaABA代谢调控网络奠定基础。
第二章:B.cinereaTB-3-H8ABA合成基因簇中bcaba1-bcaba4序列比对和转录分析
B.cinerea属不同菌株合成ABA的能力存在着很大的差异，有的甚至不能合成ABA。比较不同ABA合成能力菌株ABA合成相关基因的差异，可以为从分子水平解释ABA合成提供参考。本章从DNA水平和转录水平两个方面研究了ABA合成基因簇中基因。采取分段扩增的策略，利用PCR方法在B.cinereaTB-3-H8中得到了ABA合成相关基因bcaba1-bcaba4的全长及基因间隔序列，并与B.cinereaSAS56，B05.10和T4菌株的对应序列进行了比对分析。多序列比对发现，B.cinereaTB-3-H8的该序列分别与B.cinereaSAS56，B05.10和T4的对应序列存99.01％，98.73％和98.99％的相似度。同时发现不同菌株在bcaba1和bcaba3的基因间隔序列存在不同程度的大片段的插入与缺失。与B.cinereaTB-3-H8相比B05.10和T4两个菌株基因bcaba1和bcaba3之间序列分别多出了7141bp和2086bp。对B05.10中的该段序列进行BLAST分析发现，与反转录转座子具有较高的相似性。单基因比对发现，B.cinereaTB-3-H8中4个功能基因与其他3个菌株对应序列共存23个碱基位点的差异。为了进一步研究B.cinereaTB-3-H8中bcaba1-bcaba4表达与ABA合成的关系。利用qPCR的技术研究了ABA高产代谢调控下多个时间点每个基因的表达情况。发现4个基因在ABA大量合成时期均保持较高的表达量（2-10倍），提示bcaba1-bcaba4表达与ABA的合成紧密相关，并发现它们，尤其是bcaba4的表达模式与已报道的存在差异。本章利用生物信息学和qPCR方法，对ABA高产与不产菌株ABA合成基因簇序列及其表达进行分析，发现了ABA高产菌株B.cinereaTB-3-H8特有的序列及表达特征:一个大的片段缺失，bcaba1-bcaba4四个基因中23个碱基的差异以及四个功能基因尤其是bcaba4不同于已报道的基因的表达模式。这些差异为理性改良菌株，提高ABA产量提供了依据以及了解ABA的高产机制提供了依据。
第三章B.cinerea中自主复制载体构建
在酵母中已经有很多自主复制载体，如YAC和酵母双杂交体系的载体。这些载体极大的促进了酵母中的克隆和表达研究。但是丝状真菌中关于自主复制质粒的报非常少。已经报道ANEP8载体可以在黑曲霉中自主复制。因其含有一个来源于构巢曲霉的可使载体具备自主复制能力的5.3kb的片段AMA1。通过酶切载体ANEP8，获得自主复制元件AMA1，连接到含有潮霉素抗性的载体pLOB7上，首次在B.cinerea中构建了一个含有潮霉素抗性基因和自主复制元件AMA1的穿梭载体pLOB-AMA。并用该载体成功转化了B.cinereaBC-31，获得了16个转化株。转化效率与整合性相比提高了2倍。自主复制型载体的构建提高了载体的转化的效率，丰富了B.cinerea的遗传转化体系，极大的方便了基因敲除突变株的表型回复以及基因的过表达研究，为B.cinerea中基因功能的研究提供了一个崭新的工具。