Asial型口蹄疫病毒宿主嗜性变异的分子基础

来源 :中国农业科学院 | 被引量 : 0次 | 上传用户:oraclenienan
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病毒受体结合位点与细胞表面受体识别是启动病毒感染路径的第一步,决定着病毒感染细胞的类型(组织嗜性)和宿主嗜性,进而影响病毒对不同宿主的致病性。本研究选择Asia l型口蹄疫病毒(foot and mouth disease virus,FMDV)为靶标来研究宿主嗜性变异的分子基础,从临床表型变异到实验室,进一步研究相关受体识别位点的变异,再通过反向遗传技术,证实受体识别位点对病毒表型的影响。最后,通过建立稳定表达受体的细胞系,来证明和比较不同受体识别基序的病毒对受体路径的识别与利用效率。一、口蹄疫病毒宿主嗜性变异的临床现象的鉴定本研究是根据2006年河南某猪场规模发生严重疫情,通过病毒分离、序列测定,发现有受体识别位点变异成RDD的现象,进一步将分离毒株传代(乳鼠)、筛选(蚀斑)、序列测定,发现还存在受体结合位点变异为RSD的毒株。二、含有不同受体基序毒株的拯救及其在细胞表型差异的比较为了进一步研究这些突变对毒株致病性的影响,应用反向遗传技术,分别构建了含有RGD、RDD、RSD和缺失RGD基序(dRGD)的四种全长cDNA(这四种cDNA除了受体结合位点基序不同外,其余序列完全相同)。结果表明,含RGD、RSD和RDD基序的cDNA能够在BHK-21细胞上拯救并稳定生长,分别命名为rRGD、rRSD和rRDD,而RGD缺失的不能拯救出病毒来。为了阐明受体结合基序变异对FMDV致病性的影响,用相同剂量(1.0×104TCID50)的病毒测定其对不同动物来源细胞的致病性和复制曲线。结果表明,(1)rRSD病毒在鼠源BHK-21细胞的log TCID50/50μL为9.33,具有较强的复制曲线,而rRGD和rRDD均为6.77,具有较弱的复制曲线;(2)rRSD对SK6细胞的logTCID50/50μL为3.67,具有较弱的复制曲线,而rRGD和rRDD对SK6细胞的logTCID50/50μL分别为5.67和6.33,具有较强的复制曲线;(3)rRSD对BTY细胞的logTCID50/50μL为3.33,具有较弱的复制曲线,而rRGD和rRDD对BTY细胞的logTCID50/50μL分别为6.67和5.33。三、含有不同受体基序毒株对猪和牛的致病表型差异的比较采用喷雾和注射两种感染方式,用相同剂量(1.0×104TCID50)的病毒测定其对猪和牛的致病性。结果表明,rRSD对猪没有致病性,不能形成临床症状、血毒症和感染抗体,而对牛有较弱的致病性;注射感染时,rRDD比rRGD对猪的致病性强,喷雾方式,其表现传染性较差。四、不同受体识别基序的病毒对受体的识别与利用效率比较为了进一步解读造成宿主动物致病性差异的原因,本文从受体识别位点变异的病毒对受体路径识别与利用差异入手进行分析。克隆了FMDV整联蛋白受体亚基基因(αv、β1、β3、β6、β8),借助IRES序列连接αv和β亚基,并应用慢病毒表达系统构建能稳定表达αvβ1、αvβ3、αvβ6和αvβ8二聚体蛋白的CHO-K1细胞系,分别命名为CHO-K1-αvβ1,CHO-K1-αvβ3,CHO-K1-αvβ6,CHO-K1-αvβ8,这些试验在这四种细胞系和对照细胞CHO-K1上平行进行。利用基于细胞的(cell-based) ELISA方法,确定了αvβ6对rRGD、rRSD和rRDD三种毒的吸附能力最强。利用实时定量PCR、蚀斑形成试验以及TCID50方法,确定了rRGD对整联蛋白四种受体和硫酸乙酰肝素(heparan sulfate, HS)均可识别、利用,利用效率αvβ6>αvβ3>αvβ1>αvβ8>HS;rRDD仅能够利用αvβ8,能够形成极少量的蚀斑,利用效率很低;rRSD不利用这四种整联蛋白和HS。继而通过排除rRGD对整联蛋白和HS的利用,推断rRGD可能存在第三类受体进入细胞。这些结果为进一步解读宿主嗜性变异和临床表型变异的分子基础提供直接证据。
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