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心室重构是心力衰竭、心肌梗死、高血压心脏病及心肌病等心脏疾病的病理生理基础。心肌纤维化是心室重构的重要部分,是指心肌组织中胶原纤维过量沉积,胶原浓度和胶原容积分数显著增加,各型胶原比例失调及排列紊乱,与心律失常、心功能障碍甚至心脏性猝死密切相关。心肌纤维化使心肌组织结构紊乱,心室壁僵硬,导致心脏舒缩功能障碍及心律失常。肾素-血管紧张素系统(RAS)对心肌纤维化的发生发展具有重要作用,临床干预RAS已成为治疗相关疾病的基石。心脏组织内具有独立的RAS,能合成RAS几乎全部的成分。研究表明,组织内RAS而非循环中RAS是心肌纤维化的关键刺激因素,压力超负荷、心肌梗死、循环RAS活化等病理性刺激通过升高组织RAS活性而导致细胞肥大、心肌纤维化或心肌细胞凋亡等病理改变。血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)是RAS主要效应因子,血管紧张素转化酶(ACE)是其生成的关键酶。血管紧张素转换酶相关羧肽酶(ACE2)是ACE的一种同工酶,二者的催化结构域有大约42%的同源性,在体内与ACE分布一致。ACE2主要将八肽的AngⅡ水解为七肽的Ang(1-7)。Ang(1-7)通过其特异性受体Mas活化或抑制胞内多条信号通路,在胞内信号分子水平上拮抗AngⅡ的作用。故ACE2-Ang(1-7)-Mas轴是ACE-AngⅡ-ATl轴的内源性拮抗体系。细胞骨架是真核细胞维持其基本形态的重要结构,为胞内蛋白提供附着支架,参与细胞分裂、生长、物质运输、迁移、收缩等许多重要的生命活动。Rho激酶是小G蛋白RhoA的下游主要效应因子,被证明是调控细胞骨架重组的重要因子。近来的研究发现,Rho激酶在心脏疾病中具有重要作用。Rho激酶的活性与心力衰竭患者左室重构和泵血功能障碍程度密切相关。动物实验表明,Rho激酶特异性抑制剂法舒地尔能显著减轻压力负荷、损伤、激素(AngⅡ、醛固酮及异丙肾上腺素等)及糖尿病等因素诱导的心肌细胞肥大、心脏间质纤维化和炎症浸润,并能改善收缩性或舒张性心功能障碍。基于以上背景,Rho激酶有望成为干预心肌纤维化的有效靶点,但是其作用机制还不完全清楚。法舒地尔是目前唯一上市用于临床的Rho激酶特异性抑制剂。本研究用法舒地尔干预压力超负荷大鼠,探讨Rho激酶抑制剂对心肌ACE-AngⅡ和ACE2-Ang(1-7)的影响,为临床上将Rho激酶作为抗心室重构新靶点提供更多依据。目的：观察Rho激酶抑制剂法舒地尔对压力超负荷大鼠心肌ACE-Ang Ⅱ(?)ACE2-Ang(1-7)的影响,探讨Rho激酶在心肌纤维化中的作用。方法：雄性SD大鼠50只,体重180±20g,按随机表法选取8只大鼠作为假手术组(Sham组),剩余42只按Anversa等所用方法用腹主动脉缩窄术制备压力超负荷模型。Sham组按上述程序分离腹主动脉,但不予夹闭。4周后,大鼠存活36只,死亡14只,Sham组无死亡。成模大鼠28只,随机分为：模型对照组(Model组,n=10)、法舒地尔高剂量干预组(FH组,n=9)和法舒地尔低剂量干预组(FL组,n=9)。加上Sham组(n=8)共4组。腹腔注射给予4组大鼠的药量分别为：0.9%氯化钠2ml/kg·d (Sham组)、0.9%氯化钠2ml/kg·d (Model组)、法舒地尔2ml/kg·d(FH组,30mg/kg·d)和稀释3倍后的法舒地尔2ml/kg·d(FL组,10mg/kg·d).药物干预4周后,称重,计算心脏重量指数(HWI)和左室重量指数(]VWI)。观察心肌组织HE染色和Masson胶原染色,碱水解法测定心肌羟脯氨酸(HYP)含量,免疫组织化学分析转化生长因子(TGF-β1)、结缔组织生长因子(CTGF)、磷酸化的MYPT1、ACE和ACE2的蛋白水平,RT-PCR检测ACE2mRNA表达,ELISA检测心肌和血浆AngⅡ及Ang(1-7)的浓度。统计学方法：采用SPSS13.0软件进行统计学分析,计量数据以x±s表示。多个组间比较采用单因素方差分析。两两组间多重比较时,方差齐时用LSD检验,方差不齐时用Dunnett’s T3检验。p<0.05为差异有统计学意义。结果：1.各组大鼠心肌纤维化指标的比较与Sham组相比,Model组HWI和LVWI显著增高,心肌HYP含量升高(p<0.01),提示大鼠心肌有大量胶原蛋白沉积。与Model组相比,FH组和FL组大鼠HWI、LVWI及心肌HYP含量均有不同程度的降低,差异有统计学意义(p<0.01或p<0.05)。2.各组大鼠心肌组织HE和Masson染色结果Sham组心肌细胞排列整齐,胞质染色均一,无坏死灶,间质胶原纤维增生不明显。与Sham组相比,Model组心肌细胞增粗、紊乱,可见多个坏死灶,并有炎性细胞浸润,血管周围及间质胶原纤维大量沉积。与Model组相比,FH组心肌组织与Sham组相似,心肌细胞情况明显改善,间质纤维化程度显著减轻,间质少量胶原纤维沉积；FL组心肌细胞增粗、紊乱,可见坏死灶,少量炎性细胞浸润,血管及间质仍有胶原纤维沉积,但较Model组减轻。3.各组大鼠心肌组织p-MYPT水平比较MYPT1是Rho激酶的特异性底物,其磷酸化水平可反映Rho激酶活性。免疫组化染色为棕色提示p-MYPT1表达阳性。Sham组棕色区域散在,整体淡染；Model组棕色区域显著增多,切片深染；FH组棕色区域较Model组显著减少,整体着色与Sham组相近；FL组棕色区域较Model组减少,但染色较Sham组稍深。半定量分析结果显示,与Sham组相比,Model组p-MYPT1的MOD显著升高(p<0.01)；与Model组相比,FH组和FL组MOD均有显著降低(p<0.01)。4.各组大鼠心肌组织TGF-β1和CTGF水平比较Sham组TGF-β1免疫染色较浅,棕色区域很少；Model组染色显著加深,棕色区域显著增多；FH组棕色区域较Model组显著减少,整体颜色较Sham组稍深；FL组棕色面积及颜色介于Model组和FH组之间。半定量分析显示,Model组TGF-β1的MOD值较Sham组显著升高0<0.01)；FH组和FL组MOD较Model组有不同程度的降低(p<0.01或p<0.05)。Model组CTGF染色较Sham组棕色区域增多,染色显著加深；FH组较Model组显著淡染,棕色区域散在；FL组棕色面积及颜色介于Model组和FH组之间。半定量分析显示,与Sham组相比,Model组CTGF的MOD值升高(p<0.01)；FH组MOD与Sham组相近,较Model组显著降低(p<0.01)；FL组较Model组降低(p<0.05)。5.各组大鼠心肌ACE蛋白水平比较Sham组ACE免疫染色较浅,棕色区域很少；Model组染色显著加深,棕色区域显著增多；FH组棕色区域较Model组显著减少,整体颜色较Sham组稍深；FL组棕色面积及颜色介于Model组和FH组之间。半定量分析显示,Model组心肌ACE蛋白水平较Sham组显著升高(p<0.01),与Model组相比,FH组ACE蛋白水平将至正常水平,而FL组降低35%(p<0.05)。6.各组大鼠心肌ACE2蛋白水平比较200倍光镜下,阳性细胞被染成棕黄色或褐色。Sham组可见散在的棕色区域,细胞轮廓清晰；与Sham组相比,Model组棕色区域更加少见,切片淡染；与Model组相比,FH组棕色区域明显增多,可见成片的阳性细胞,切片染色较深,FL组较Model组棕色区域也显著增多,但切片整体染色比FH组稍浅。半定量分析显示,Model组ACE2蛋白水平较Sham组显著降低(p<0.01)；与Model组比较,法舒地尔可显著升高心肌ACE2蛋白水平,FH组ACE2升高197%,FL组升高136%(p<0.01)。7.各组大鼠心肌ACE2mRNA表达水平的比较与Sham组相比,Model组大鼠心肌组织ACE2mRNA表达显著降低(p<0.01)；与Model组相比,法舒地尔显著升高ACE2mRNA的表达,FH组ACE2mRNA表达升高181%,而FL组ACE2mRNA表达升高119%(p<0.01)。8.各组大鼠心肌和血浆AngⅡ、Ang(1-7)的浓度比较大鼠心肌组织中,Model组AngⅡ升高,Ang(1-7)显著降低(p<0.01),Ang Ⅱ/Ang(1-7)比值显著升高；FH组Ang Ⅱ水平与Sham组相似,Ang(1-7)水平较Model组升高213%(p<0.01),AngⅡ/Ang(1-7)被逆转而<1；与Model组相比,FL组Ang Ⅱ水平降低35%(p<0.05),Ang(1-7)水平升高76%(p<0.01),Ang Ⅱ/Ang(1-7)降低至sham组水平。与Sham组相比,Model组血浆AngⅡ显著升高(p<0.01),但是血浆Ang(1-7)改变无统计学意义,AngⅡ/Ang(1-7)比值显著升高；与Model组相比,FH组血浆AngⅡ水平降低了49%,Ang(1-7)升高了106%(p<0.01),血浆AngⅡ/Ang(1-7)显著降低；与Model组相比,FL组Ang II水平降低了33%,Ang(1-7)升高了43%(p<0.01),血浆AngⅡ/Ang(1-7)降至Sham组水平。结论：1.腹主动脉缩窄诱导的压力超负荷可诱导明显的心肌纤维化,伴有心肌ACE、Ang Ⅱ升高和ACE2、Ang(1-7)的降低。2.Rho激酶参与压力超负荷诱导的心肌纤维化进程,其活性与AngⅡ、 TGF-β1和CTGF水平相一致。3.法舒地尔抑制Rho激酶活性后,可明显改善腹主动脉缩窄诱导的心肌纤维化,降低心肌ACE、AngⅡ、TGF-β1及CTGF水平,升高ACE2和Ang(1-7)的水平。4.法舒地尔抑制压力超负荷诱导的心肌纤维化的作用与心肌TGF-β1、 CTGF水平的降低、心肌ACE-Ang Ⅱ/ACE2-Ang(1-7)的改善有关。