论文部分内容阅读
研究背景年龄相关性黄斑变性（AMD）、视网膜色素变性（RP）和Stargardt病等视网膜退行性疾病严重危害视功能,最终可能造成不可逆性盲。视网膜退行性疾病的发病机制包括多种视网膜功能相关基因突变和危险环境因素。而过度的光照作为其中一种有害的环境因素,在视网膜退行性疾病的发病机制中起着至关重要的作用。感光细胞死亡是视网膜退行性疾病的重要的病理特征,然而光诱导视网膜感光细胞死亡的具体机制尚不十分明确。过度的光照可以引起视网膜的光热损伤、光机械损伤和光化学损伤。其中,光化学损伤在视网膜光损伤中起主导作用。视网膜在暴露于强光后,视紫红质可以吸收光子并激活电离效应,形成氧化自由基。过度的光照刺激下自由基的合成降解失衡,产生过量的活性氧簇（ROS）导致氧化应激水平上升,此时失衡的抗氧化系统无法将产生的活性氧簇有效清除,因此内部抗氧化系统受损,最终造成哺乳动物视网膜中氧化应激的超载。在某些刺激作用下,细胞凋亡的进程受到一系列信号级联的有序调节,其中含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（Caspase）依赖途径是一种经典的凋亡途径,通过活化一系列半胱氨酸蛋白水解酶来调节细胞凋亡和炎症,维持体内平衡。它可以通过两种途径被激活,一种是死亡信号诱导,死亡受体介导的外源性途径;另一种是应激诱导,线粒体介导的内源性途径。在我们前期研究发现,在661W细胞的葡萄糖剥夺模型中,凋亡相关蛋白Caspase-3和Caspase-9蛋白的表达水平明显上升,Caspase抑制剂Z-VAD-fmk的使用可以抑制Caspase-3、Caspase-9蛋白的表达,同时抑制了内源性与外源性细胞凋亡通路。然而Z-VAD-fmk不能改善光损伤模型中661W细胞死亡情况,说明光损伤存在着其他可能的非Caspase死亡机制。Parthanatos是一种依赖核酶聚腺苷酸二磷酸核糖转移酶-1（PARP-1）的过度激活而发生的独特细胞死亡形式。该途径涉及PARP-1的过度激活快速活化,合成积累大量的PAR聚合物,随后线粒体去极化,凋亡诱导因子（AIF）向细胞核内转移,染色体的大片段降解,最终导致细胞死亡。与凋亡不同,parthanatos死亡不会被Caspase抑制剂所抑制,也不会产生凋亡小体和小片段的DNA碎片,而是会产生大片段的DNA碎片。在光损伤模型中,过度光照导致氧化应激损伤,过量的ROS穿透核膜,导致核DNA链断裂,DNA损伤会过度激活细胞核中PARP-1,造成细胞内烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）缺乏、糖酵解速率减慢、电子呼吸链传递受阻、腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）池耗尽从而启动程序性细胞死亡。因此我们推测parthanatos死亡可能参与了光损伤模型中视网膜感光细胞的死亡机制。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）是一种存在于几乎所有真核细胞中的丝氨酸苏氨酸蛋白激酶,调节细胞的生长,蛋白质合成,基因表达和代谢平衡等。mTOR通路功能障碍涉及多种神经退行性疾病,同时mTOR信号的激活广泛参与各种视网膜变性疾病,包括糖尿病视网膜病变和年龄相关性黄斑变性等。因此mTOR也是治疗多种视网膜退行性疾病的主要靶点。mTOR抑制剂雷帕霉素可能通过减少ROS的产生并抑制氧化应激,改善线粒体功能紊乱,保护感光细胞免受退行性死亡。661W细胞系由小鼠感光经永生化获得,其SV40-T抗原表达受编码人视网膜受体结合蛋白基因启动子的控制。该细胞系兼具有锥状感光细胞的结构和生化特性,是体外研究感光细胞生物学的有效模型。本研究利用661W细胞光损伤模型,在体外阐明光诱导的感光细胞死亡的机制、抑制mTOR和PARP-1信号通路对感光细胞死亡的神经保护作用,以及AIF介导作用;并在体内建立小鼠视网膜光损伤模型,探讨抑制mTOR和PARP-1信号通路对视网膜的保护机制。方法1.探讨抑制mTOR和PARP-1信号通路对光损伤中感光细胞的保护作用（1）使用慢病毒感染661W细胞,制备慢病毒敲低的mTOR细胞株（mTOR KD）和PARP-1细胞株（PARP-1KD）以及慢病毒搭载无效的序列感染661W细胞作为阴性对照（Scramble）。（2）在体外制备光损伤细胞模型,并将细胞分为正常661W组、Scramble组（阴性对照组）、Lt 661W组（光损伤661W组）、Lt Scramble组（光损伤阴性对照组）、Lt mTOR KD组（光损伤mTOR敲低组）、Lt PARP-1 KD组（光损伤PARP-1敲低组）。利用Hoechst/PI法和Western Blot等方法检测不同实验组的细胞死亡情况及探究抑制mTOR和PARP-1信号通路保护作用的机制。2.探讨抑制AIF信号通路对光损伤中感光细胞的保护作用（1）使用慢病毒感染661W细胞,制备慢病毒敲低的AIF细胞株（AIF KD）。（2）在体外制备光损伤细胞模型,并将细胞分为正常661W组、Scramble组（阴性对照组）、Lt 661W组（光损伤661W组）、Lt Scramble组（光损伤阴性对照组）、Lt AIF KD（光损伤AIF敲低组）组。利用Hoechst/PI法和Western Blot等方法检测不同实验组的细胞死亡情况及探究抑制AIF信号通路保护作用机制。3.检测在光损伤条件下AIF活化核易位现象（1）使用AIFGFP质粒瞬时转染661W细胞,制备AIFGFP细胞株即AIF被绿色荧光标记的细胞株。（2）在体外制备光损伤AIFGFP细胞模型,并将细胞分为AIFGFP组和Lt AIFGFP组。在与进行Hoechst共染色后,在共聚焦显微镜下观察绿色荧光标记的AIF向细胞核内转移的现象。（3）在体外制备光损伤细胞模型,并将细胞分为正常661W组、Scramble组（阴性对照组）、Lt 661W组（光损伤661W组）、Lt Scramble组（光损伤阴性对照组）、Lt mTOR KD组（光损伤mTOR敲低组）、Lt PARP-1 KD组（光损伤PARP-1敲低组）,对各组细胞进行细胞核细胞质组分分离,并采用Western Blot法检测光损伤细胞模型中细胞核组分中57kDa AIF蛋白表达情况。4.探讨SIRT1信号通路在mTOR和PARP-1信号通路之间的作用在体外制备光损伤细胞模型,并将细胞分为正常661W组、Scramble组（阴性对照组）、Lt 661W组（光损伤661W组）、Lt Scramble组（光损伤阴性对照组）、Lt mTOR KD组（光损伤mTOR敲低组）、Lt PARP-1 KD组（光损伤PARP-1敲低组）。利用Western Blot以及Quantitative real-time PCR等方法检测不同实验组SIRT1蛋白和mRNA的表达。采用Hoechst/PI法观察在光损伤细胞模型中SIRT1抑制剂EX527或者溶剂的预处理对正常661W组、Scramble组（阴性对照组）、Lt 661W组（光损伤661W组）、Lt Scramble组（光损伤阴性对照组）、Lt mTOR KD组（光损伤mTOR敲低组）、Lt PARP-1 KD组（光损伤PARP-1敲低组）死亡情况的影响;采用Western Blot法检测EX527或者溶剂的预处理在光损伤细胞模型中对mTOR和PARP-1信号通路之间相互作用的影响。5.探讨抑制mTOR和PARP-1信号通路对小鼠视网膜光损伤的影响建立小鼠视网膜光损伤的体内模型,并分为正常（Control）组、单纯光照（Lt+Vehicle）组、雷帕霉素治疗（Lt+RAPA）组、3AB治疗（Lt+3AB）组。通过ERG（a波b波振幅）功能上评估mTOR抑制剂雷帕霉素（RAPA）和PARP-1抑制剂3AB对小鼠光损伤视网膜的保护作用;对小鼠眼球进行石蜡切片HE染色,结构上观察光损伤条件下RAPA和3AB对小鼠视网膜ONL厚度以及细胞核数量的影响;利用Western Blot法检测RAPA和3AB对光损伤视网膜中mTOR、PARP-1信号通路蛋白（mTOR、p-mTOR、p-4EBP1、p-S6K1、PARP-1、PAR、AIF）的影响。结果1.过量的光照导致661W细胞的死亡率大幅度增加,而抑制mTOR或者PARP-1信号通路在光损伤条件下能够明显降低感光661W细胞的死亡率。过量的光照可以激活mTOR以及PARP-1通路,导致57kDa AIF蛋白增多。Lt mTOR KD组中PARP-1、PAR蛋白的表达下降,Lt PARP-1 KD组中p-mTOR、p-4EBP1、p-S6K1蛋白的表达下降,p-mTOR/mTOR比值下降。并且Lt mTOR KD组、Lt PARP-1 KD组中57kDa AIF蛋白减少。2.抑制AIF信号通路在光损伤条件下能够降低视网膜感光661W细胞的死亡率,AIF敲低并不能抑制PARP-1或者mTOR通路的活化,说明mTOR、PARP-1信号通路位于AIF的上游。3.光照能够激活AIF,在Lt AIFGFP组明显观察到绿色荧光向细胞核内迁移。Western Blot法检测发现,光照后细胞核组分活化的57kDa AIF蛋白表达增加。而mTOR或者PARP-1敲低都分别会使细胞核组分中活化57kDa AIF蛋白减少,说明过量的光照可以诱导AIF核易位;mTOR、PARP-1信号通路位于AIF的上游,抑制mTOR、PARP-1信号通路可以抑制下游因子AIF核易位。4.SIRT1抑制剂EX527能够部分阻断mTOR和PARP-1信号通路抑制对光损伤中感光细胞的保护作用;并且EX527能够部分重新上调光损伤中mTOR敲低组中PARP-1、PAR蛋白的表达水平,以及PARP-1敲低组中p-mTOR、p-4EBP1、p-S6K1蛋白的表达水平,说明SIRT1是mTOR与PARP-1信号通路间相互调控的重要中间因子。5.在动物视网膜光损伤模型中,雷帕霉素和3AB分别能够改善光损伤导致的ONL层变薄、结构紊乱以及感光细胞核的减少的情况,减轻光损伤导致的a波b波振幅下降,改善视网膜功能;有效抑制光损伤诱导的mTOR和PARP-1信号通路活化。结论1.在光损伤模型中,mTOR、PARP-1信号被激活,AIF裂解活化,向细胞核内转移,导致parthanatos细胞死亡,并且mTOR、PARP-1信号之间存在着相互作用;2.抑制AIF可以降低光损伤模型中的视网膜感光细胞的死亡率;3.mTOR、PARP-1位于AIF的上游,抑制mTOR、PARP-1通过抑制AIF核易位,降低光损伤模型中的视网膜感光细胞的死亡率;4.在光损伤模型中SIRT1是mTOR与PARP-1间信号调控的重要的中间因子;5.抑制mTOR、PARP-1通过阻断AIF途径保护小鼠光损伤模型中的视网膜功能和结构。