研究背景和研究目的病毒感染引起的神经系统损伤已经逐渐成为临床上最常见的中枢神经系统感染性疾病,虫媒病毒类,肠道病毒等多重病毒感染均可以引发不同程度神经系统症状。可能诱发脑炎脑膜炎的病毒包括虫媒病毒类的东方马脑炎病毒、西方马脑炎病毒、委内瑞拉脑炎病毒病毒、森林脑炎病毒、流行性乙型脑炎病毒和西尼罗病毒,副粘病毒科尼帕亨德拉病毒属的尼帕病毒、亨德拉病毒；以及副粘病毒科肠道病毒属的肠道病毒71型、柯萨奇病毒A组16型、柯萨奇B组病毒、脊髓灰质炎病毒,这12种病毒均为RNA病毒,且都为烈性传染病病原,在平时可造成烈性传染病爆发流行,在战时可作为生物武器,在全世界范围内都曾造成严重传染病的流行。这12种病毒临床上都表现为脑炎脑膜炎的症状,如发热、头疼、咳嗽、腹泻、呕吐、意识模糊、抽搐、颈项强直、呼吸衰竭、多器官损伤,甚至导致死亡等,临床上很难鉴别是哪种病毒感染,因此亟待研究一种早期快速准确鉴别这12种病毒的检测方法。目前常用的检测手段有病毒分离、免疫学检测和PCR等方法。传统检测方法中,病毒分离培养是诊断金标准,但对实验条件要求高,所需时间较长,工作量较大,同一时期无法处理大量样本。而免疫学检测中,病毒易变异、样本中存在多个有交叉同源性的病毒等因素均有可能影响检测结果。随着近年来分子生物学诊断技术迅猛发展,荧光定量PCR技术成为传染病病原基因诊断方法中越来越受到关注的一种重要手段。荧光定量PCR(FQ-PCR)技术是一种目前国内外应用较为广泛的定量PCR技术,是通过始点定量和荧光检测系统实时监测累积荧光强度而实现的,其中,以TaqMan探针法标记的FQ-PCR技术应用最广泛。该技术克服了传统检测技术由于样品病原含量较低带来的检测难度,在数小时内即可确定传染病病原体的种类,具有灵敏度高,特异性强、线性关系好、操作简单、自动化程度高、防污染并且高通量,快速等特点,现已广泛应用于人类和动物传染性疾病的定性定量检测。近年欧美等发达国家应用荧光定量PCR技术已经研究了对病原体的快速检测,整体研究水平较高,主要是对单个或同属病原体的确定上具有明显优势,我国作为传染病多发大国,目前尚无针对突发传染病病原体的高通量、快速鉴别新型集成技术和可靠平台,防控新发、再发、突发传染病是我们的基本国策,因此我国对重要传染病病原进行检测、鉴定和溯源能力亟待提高。荧光定量PCR Array是目前较为简单实用的一种检测基因表达的方法,具有快速、高通量、高集成和易推广等优点。针对本研究,我们利用该技术在单板上进行多种病原体的实时荧光定量PCR检测,建立了单板多病原的高通量检测技术平台,使一次PCR反应可以同时快速检出数十种病原体,尤其在临床致病情况尚不清晰的情况下,可快速进行特异病原体的鉴定,该检测技术的高通量和集成化,为快速鉴定和识别引发急性传染病的未知病原体提供了高效的解决方案。和单个病原分开上机检测相比,一次性检测某一类症候群病原,几个小时内就排除单一病原感染或联合多个病原的交叉感染,缩短了鉴别诊断时间,还可以减少人力投入、检测试剂和样本量。荧光定量PCR对脑炎脑膜炎病毒进行定性和定量检测,想要得到可靠的结果,必须得有标准品和质控品的控制,同时由于脑炎脑膜炎这12种病毒是烈性传染病病原,致病性高,而且有些病毒感染在我国罕见报道,给研究带来极大困难和危险,在这样的背景下,通过假病毒包装技术制备标准品将会是一种非常安全可靠的研究手段。假病毒(pseudotype virus),是指种病毒拥有自己的遗传物质,囊膜上却包被有另一种病毒的糖蛋白,因而具有了另一种病毒的感染特征。假型病毒与提供囊膜蛋白的真病毒一样,对宿主细胞有同样的侵染性。这种基因型和表现型不致的现象叫假型,具有这种特征的病毒叫假病毒,这种病毒只能进行“一个细胞周期”的侵染,生物安全性比较强。以逆转录病毒载体为基础,将要包装的外源基因结合报告基因通过转染,将外源基因整合到宿主细胞基因组中实现稳定表达(建立细胞系)或瞬时表达的目的。通过逆转录病毒的复制,以及载体提供的包装信号,即可得到一种外源基因被逆转录病毒衣壳包裹的复制缺陷型的假病毒颗粒。使用内含目的RNA的假病毒颗粒作为RNA病毒荧光定量RT-PCR检测的质控品和标准品不仅无生物传染危险性,而且在核酸提取中,对病原体内RNA有很好的模拟作用,同时假病毒RNA不易对实验仪器和环境造成交叉污染而导致假阳性结果,避免了以往研制的商品化试剂盒中常用质粒标准品不能很好地对样品进行处理及对反转录过程进行有效控制的问题。所以本研究拟采用脑炎脑膜炎症候群的东方马脑炎病毒、西方马脑炎病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、森林脑炎病毒、流行性乙型脑炎病毒、西尼罗病毒、尼帕病毒、亨德拉病毒、肠道病毒71型、柯萨奇病毒A16型、柯萨奇病毒B型、脊髓灰质炎病毒共12种病毒为研究对象,通过构建含上述12种病毒基因的逆转录病毒表达载体,以假病毒包装技术筛选建立GP2-293产毒细胞系,以产毒细胞系生产的假病毒颗粒作为参考标准品,进行TaqMan一步法荧光定量RT-PCR Array一次性检测上述12种脑炎脑膜炎病毒,从而达到早期快速鉴别诊断的目的。方法：1.12利,脑炎脑膜炎假病毒参考标准品的制备选择国内外文献报道最多的12种脑炎脑膜炎病毒各自的特异性靶基因,从GeneBank下载各病毒特异性基因序列,通过生物学软件,在各自基因的保守区域,设计特异的引物和探针,为了能够在96孔板中一次性鉴别诊断出脑炎脑膜炎症候群的这12种病毒,以上设计最后使荧光定量PCR的扩增片断大小均统一在50～150bp之间,且拥有类似的GC含量和Tm值,以致12种病毒都能在统一的反应条件和反应体系中进行荧光定量PCR检测。然后将设计的12对引物探针,按次序依次组合在一条基因序列上,由公司合成设计的12种脑炎脑膜炎病毒全长基因,并构建含12种脑炎脑膜炎基因的重组PLPCX逆转录病毒载体；重组质粒经测序正确后,和包膜质粒PVSVG共转染入逆转录病毒包装细胞GP2-293,包装成假病毒颗粒,转染后的GP2-293包装细胞,采用G418筛选产毒细胞克隆,扩大培养产毒细胞克隆,筛选期间每隔3～4天收集一次细胞培养上清,共收集14次。荧光定量PCR排除DNA污染后,通过建立一步法荧光定量RT-PCR方法验证GP2-293产毒细胞系目的基因的转录表达情况,即所收集的病毒上清中假病毒滴度变化。2.脑炎脑膜炎症候群12种病毒TaqMan一步法荧光定量RT-PCR Array检测方法的建立以收集的假病毒颗粒作为参考标准品,均一化反应体系和反应条件,建立最优化的TaqMan探针一步法荧光定量RT-PCR Array,在一块板中能够一次性鉴别诊断脑炎脑膜炎症候群的东方马脑炎病毒、西方马脑炎病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、森林脑炎病毒、流行性乙型脑炎病毒、西尼罗病毒、尼帕病毒、亨德拉病毒、肠道病毒71型、柯萨奇病毒A组16型、柯萨奇B组病毒、脊髓灰质炎病毒12种病毒,同时评价该检测方法的灵敏度、重复性和特异性。结果：1.测序鉴定证实脑炎脑膜炎12种病毒基因正确插入逆转录病毒表达载体,成功构建含12种脑炎脑膜炎病毒基因的重组逆转录病毒载体PLPCX-EEPV。2.用脂质体法将重组逆转录病毒表达载体PLPCX-EEPV和质粒PVSV-G共转染入GP2-293包装细胞,荧光定量PCR及RT-PCR鉴定所提取的病毒RNA中已完全去除DNA污染后,成功包装出假病毒颗粒,并通过建立标准曲线法评价经G418筛选获得的稳定产毒细胞株,结果表明细胞株生产的假病毒滴度最高达107copies/μl。3.以假病毒RNA作为参考标准品模板,确定TaqMan一步法荧光定量RT-PCR Array统一的反应体系如下：2×一步法RT-PCR Buffer12.5μ1,上游引物0.1μl,下游引物0.1μl,探针μl,DEPC水4.2μl,热启动Taq酶0.5/μl,逆转录酶0.5μl, dNTPs0.4μl,RNA酶抑制剂0.5μl,一步法酶稀释液1.1μl,RNA模板51μl,总体积为25μl。统一的反应条件如下：50℃逆转录15min,95℃预变性15min,95℃变性5s,60℃退火/延伸45s,变性退火/延伸40个循环。4.方法学的评价结果：(1)绘制了以假病毒参考标准品RNA拷贝数为分析指标的定量标准曲线,所绘制的标准曲线斜率均位于理论值-3.0～-3.5范围之间；Ct值与起始模板拷贝数的对数相关性都达到0.98以上,扩增效率也都满足90～120%的要求。(2)灵敏度结果显示：脑炎脑膜炎症候群12种病毒用建立的TaqMan一步法荧光定量RT-PCR Array检测,最低检测限范围在101～102copies/μl之间,而常规的RT-PCR方法检测最低限范围为104～105copies/μl。(3)重复性结果显示：高拷贝(106copies/μl)标准品的分析内CV为0.411%～2.358%,分析间CV为0.585%～4.024%；中拷贝(104拷贝/μ1)标准品的分析内CV为0.242%～2.109%,分析间CV为0.821%～3.070%；低拷贝(102copies/μl)标准品的分析内CV为0.412%～2.160%,分析间CV为0.602%～2.973%,各浓度Ct值间变异系数均较小(CV<5%)。(4)特异性结果显示：东方马脑炎病毒、西方马脑炎病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、森林脑炎病毒、流行性乙型脑炎病毒、西尼罗病毒、尼帕病毒、亨德拉病毒、肠道病毒71型、柯萨奇病毒A16型、柯萨奇病毒B型、脊髓灰质炎病毒这12种脑炎脑膜炎病毒,与其他参考样品肠道病毒75型、登革病毒、霍乱弧菌01、霍乱弧菌O139、大肠杆菌O157均无交叉反应。结论：通过假病毒包装技术成功制备出含12种脑炎脑膜炎病毒基因的假病毒颗粒,病毒滴度达107copies/μl,直接采用该假病毒RNA作为参考标准品,建立的TaqMan一步法荧光定量RT-PCR Array检测体系灵敏度高、重复性好、特异性强,可用于脑炎脑膜炎症候群中东方马脑炎病毒、西方马脑炎病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、森林脑炎病毒、流行性乙型脑炎病毒、西尼罗病毒、尼帕病毒、亨德拉病毒、肠道病毒71型、柯萨奇病毒A组16型、柯萨奇B组病毒、脊髓灰质炎病毒12种病毒的一次性快速检测和鉴别诊断。