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第一部分大鼠放射性视网膜病变模型的建立目的 通过直线加速器照射大鼠制作放射性视网膜病变大鼠模型,观察放射对大鼠视网膜组织形态的变化,明确放射性视网膜病变的直观实验证据。方法30只2月龄SD大鼠,随机分为正常组和模型组,每组15只。直线加速器照射眼部,单次剂量10 Gy。模型组每周放射1次,连续3周,合计剂量30 Gy。2组分别于照射后第4周、第8周各取5只老鼠处死,电镜下摘眼球固定切片,行HE染色,对比观察分析视网膜各层细胞及组织的变化。结果 与正常组比较,造模后第4周、第8周时视网膜细胞形态异常,以节细胞层、内核层细胞形态异常为主。多数节细胞呈细胞水样变性,胞核偏于胞浆一侧。内核层细胞体积变小,胞核染色体固缩。节细胞层水肿,内核层、外核层水肿,细胞排列紊乱。结论 大鼠眼部放射后早期即出现视网膜细胞形态及视网膜组织结构的明显异常。第二部分Shh信号通路在大鼠放射性视网膜模型中的表达研究目的基于Shh信号通路,探索大鼠放射性视网膜病变的发病机制,为研究防治放射性视网膜病变提供新的研究思路与方向。方法30只2月龄SD大鼠,随机分为正常对照组和模型组,每组15只。直线加速器照射眼部,单次剂量10 Gy。模型组每周放射1次,连续3周,合计剂量30 Gy。2组大鼠分别于照射后第4周、第8周各取5只老鼠处死,电镜下摘眼球。左眼球固定后组织切片,免疫组化检测VEGF、HIF-1α。右眼球沿角巩膜缘切开分离出视网膜,Western Blot测定PEDF、Shh、Patched、Glil蛋白含量,RT-PCR法测定Shh、Patched、Glil基因含量。采用SPSS17.0软件对所有数据进行分析,专业医学绘图软件Graphpad Prism 6做图。结果1.VEGF检测：与正常组比较,大鼠眼部在放射造模后第4周、第8周视网膜组织VEGF蛋白表达水平则显著升高(p<0.01)；随时间的延长,VEGF蛋白表达水平有持续升高趋势。2.PDEF检测：与正常组比较,大鼠眼部在放射造模后第4周、第8周视网膜组织PEDF蛋白表达水平则显著降低(p<0.01)；随时间的延长,PEDF蛋白表达水平有降低趋势。3. HIF-1α检测：与正常组比较,大鼠眼部在放射造模后第4周视网膜组织HIF-1α蛋白表达水平则显著升高(p<0.01)；造模后第8周视网膜组织HIF-1α蛋白表达无统计学差异(p>0.05),但较正常组比较仍有升高趋势。4.Shh信号通路检测：在正常大鼠成熟视网膜Shh、Patched、Glil蛋白几乎不表达。与正常组相比,大鼠眼部放射4周、8周后,视网膜组织中Shh蛋白、Patched蛋白、Glil蛋白表达及Shh mRNA、Patched mRNA、Glil mRNA水平均显著升高(均p<0.01),随时间的延长,相关蛋白表达及基因水平有升高的趋势。结论放射大鼠眼部早期,眼部视网膜组织中PEDF表达下降,Shh信号通路活性及HIF-1α级联蛋白表达增强,作为引起VEGF高度表达的机制之一,促进视网膜新生血管的生成。第三部分芪明颗粒调控放射性视网膜病变Shh信号通路的机制研究目的基于芪明颗粒对视网膜血管病变的治疗作用,以Cyclopamine作为阳性对照药研究芪明颗粒对大鼠放射性视网膜病变(RR)早期的视网膜病理改变及Shh信号通道的影响。方法60只2月龄SD大鼠,随机分为正常组、模型组、阳性对照组和芪明颗粒组共4组,每组15只。除正常组外,其余各组大鼠麻醉后进行直线加速器照射眼部,单次剂量10 Gy,每周放射1次,连续3周,合计剂量30 Gy。造模后第二天开始,正常组和模型对照组的大鼠生理盐水灌胃,1ml/次,1次／天。阳性药物组以2.5mg/ml Cyclopamine 2ul玻璃体注射,2次／周。芪明颗粒组以浓度为0.81g/ml芪明颗粒按2.7g/kg的剂量进行灌胃,1次／天。分别于造模后第4周、8周各组大鼠中随机取5只大鼠处死后电镜下摘除眼球,左眼球固定后组织切片,行HE染色观察视网膜组织形态,免疫组化检测VEGF、HIF-1α。右眼球沿角巩膜缘切开分离出视网膜,Western Blot测定PEDF、Shh、Patched、Glil蛋白含量,RT-PCR去测定Shh、Patched. Glil mRNA含量。采用SPSS17.0软件对所有数据进行分析,专业医学绘图软件Graphpad Prism 6做图。结果1.视网膜组织形态：治疗4周：与模型组比较,芪明颗粒组内核层、外核层水肿明显好转,细胞排列紊乱明显好转。与阳性对照组比较,节细胞层水肿更明显,内核层、外核层稍水肿、细胞排列稍紊乱。与正常组比较,视网膜节细胞形态异常,节细胞呈细胞水样变性,胞核偏于胞浆一侧。内核层细胞体积变小,胞核染色体固缩,细胞排列紊乱,内核层、外核层细胞排列稍紊乱。治疗8周：与模型组比较,芪明颗粒组节细胞层、内核层、外核层水肿明显好转,细胞排列更整齐紧密。与阳性对照组比较,内核层细胞形态略异常,其他无明显差异。与正常组比较,内核层细胞形态稍异常,无明显其他异常。2. VEGF检测：治疗4周：与模型组比较,芪明颗粒组大鼠视网膜组织VEGF蛋白表达水平显著降低(p<0.01)；阳性对照组的大鼠视网膜组织VEGF蛋白表达水平降低(p<0.05)。与阳性对照组比较,芪明颗粒组大鼠视网膜组织VEGF蛋白表达无显著的统计学差异(p>0.05)。治疗8周：与模型组比较,芪明颗粒组大鼠视网膜组织VEGF蛋白表达水平降低趋势(p>0.05)；阳性对照组大鼠视网膜组织VEGF蛋白表达水平有降低趋势(p>0.05)。与阳性对照组比较,芪明颗粒组大鼠视网膜组织VEGF蛋白表达无统计学差异(p>0.05)。3. PDEF检测：治疗4周：与模型组比较,阳性对照组及芪明颗粒组大鼠视网膜组织PEDF蛋白表达水平均升高(p<0.05)。与阳性对照组比较,芪明颗粒组大鼠视网膜组织PEDF蛋白表达无统计学差异(p>0.05)。治疗8周：与模型组比较,阳性对照组和芪明颗粒组大鼠视网膜组织PEDF蛋白水平表达水平升高(p<0.05)。与阳性对照组比较,芪明颗粒组大鼠视网膜组织PEDF蛋白表达无显著统计学差异(p>0.05)。4.HIF-1α检测：治疗4周：与模型组比较,芪明颗粒组HIF-1α蛋白水平显著降低(p<0.01)；阳性对照组大鼠视网膜组织HIF-1α蛋白变化有降低趋势(p>0.05)。与阳性对照组比较,芪明颗粒组大鼠视网膜组织HIF-1α蛋白表达无统计学意义(p>0.05)。治疗8周：与模型组比较,阳性对照组和芪明颗粒组大鼠视网膜组织HIF-1α蛋白表达水平均有降低趋势(p>0.05)。与阳性对照组比较,芪明颗粒组大鼠视网膜组织HIF-1α蛋白表达变化不明显(p>0.05)。5.Sbh信号通路检测：治疗4周：与模型组比较,芪明颗粒组大鼠视网膜组织Shh蛋白、Patched蛋白、Gli1蛋白表达水平均显著降低(均p<0.01),Shh mRNA.Patched mRNA降低(p<0.05),Gli1 mRNA水平显著降低(p<0.01)。与阳性对照组比较,芪明颗粒组大鼠视网膜组织Shh蛋白表达下降明显(p<0.01),而Patched蛋白、Gli1蛋白表达差异无统计学意义(p>0.05)。Shh mRNA水平较低(p<0.05),Patched mRNA.Gli1 mRNA水平无明显差异(p>0.05)。治疗8周：与模型组比较,芪明颗粒组大鼠视网膜组织Shh蛋白.Patched蛋白、Gli1蛋白表达水平均降低(均p<0.01)：Shh mRNA.Gli1 mRNA水平降低(p<0.05),Patched mRNA水平显著降低(p<0.01)。与阳性对照组比较,芪明颗粒组大鼠视网膜组织Shh蛋白表达水平显著降低(p<0.01),而Palched蛋白、Gli1蛋白表达水平差异无统计学意义(p>0.05)；Shh mRNA水平较低(p<0.05),Patched mRNA.Gli1 mRNA水平无明显差异(p>0.05)。结论芪明颗粒早期干预放射引起的视网膜损伤,可减轻视网膜水肿,保护视网膜组织结构。可能会通过促进PEDF表达,抑制Shh通路活性,减少HIF-1α表达,一定程度上抑制VEGF的产生,进一步抑制视网膜新生血管的发生与发展,对放射性视网膜病变有一定的保护作用。