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研究背景与目的恶性肿瘤不同于正常组织最重要的代谢特点是能量耗损远超过所能获得的能量供应,肿瘤细胞及其周围具有促肿瘤功能的肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)常处于饥饿状态。然而,肿瘤细胞和TAMs会通过调节特定的代谢机制感知并适应各种极端环境从而得以存活。通过选择性地控制TAMs或者肿瘤细胞中的某些代谢途径,可以阻断相应的恶性表型。半乳糖凝集素-3(Galectin-3,Gal-3)是一种β-半乳糖苷结合蛋白,广泛分布于各种肿瘤细胞和TAMs中并参与肿瘤发展的多个过程。本研究将通过分析Gal-3在各种极端环境下对TAMs和乳腺癌MDA-MB-231细胞代谢途径的影响,探究干扰Gal-3的表达是否可以改变TAMs和乳腺癌细胞的代谢行为,削弱两者适应极端环境的能力,进而抑制乳腺癌细胞的生长和转移,旨在为开发通过靶向Gal-3来调控TAMs和肿瘤细胞的代谢途径进而抑制肿瘤发展的化合物或干预手段提供新思路。实验方法和结果实验方法:1.THP-1细胞向TAMs和M2型巨噬细胞的分化及鉴定采用MDA-MB-231细胞条件培养基诱导人外周血单核细胞系THP-1细胞分化为TAMs,或者采用细胞因子刺激THP-1细胞分化为M2型巨噬细胞用于后续实验对比。采用流式细胞术和RT-PCR法分别对TAMs和M2型巨噬细胞的特征抗原分子表达水平以及细胞因子转录水平进行M2表型鉴定。2.缺氧缺营养模型的建立采用不同条件培养基分别建立TAMs、M2型巨噬细胞和MDA-MB-231细胞缺氧模型、缺糖模型、缺血清模型、缺氧缺糖模型和缺氧缺血清模型,以模拟上述细胞在肿瘤微环境中应对的各种极端环境。采用免疫荧光实验检测不同极端培养条件下细胞中HIF-1α的表达及活性,验证由Na2S2O4所营造的缺氧环境是否成功。3.检测不同培养条件下干扰Gal-3对细胞生存率及糖酵解水平的影响通过siRNA干扰TAMs、M2型巨噬细胞以及MDA-MB-231细胞中Gal-3的表达,采用MTT法检测在不同极端环境下细胞生存率的变化,采用代谢相关试剂盒检测细胞的葡萄糖摄取量、乳酸产生量、乳酸分泌量以及细胞内乳酸脱氢酶(LDH)活力,采用Western blot法检测细胞内丙酮酸脱氢酶(PKM2)的表达量变化,综合分析细胞内的糖酵解水平。4.确定Gal-3调控TAMs和MDA-MB-231细胞代谢途径的分子机制采用Western blot法检测不同极端培养环境对TAMs和MDA-MB-231细胞内的Gal-3以及代谢相关调控蛋白(PI3K、NF-κB、AMPK和P-AMPK)表达水平的影响。为探索缺氧缺营养条件下AMPK与Gal-3之间的调控关系,在缺氧缺糖的培养条件下加入AMPK抑制剂Compound C,在缺氧缺血清的培养条件下加入AMPK激动剂AICAR,采用Western blot法检测细胞中Gal-3的表达情况。为验证在缺氧缺糖条件下AMPK,NF-κB和Gal-3三者之间的调控关系,采用免疫荧光法检测NF-κB在Compound C存在下的活性变化,采用Western blot法检测加入NF-κB抑制剂PDTC对Gal-3蛋白表达的影响。为进一步明确AMPK、PI3K与Gal-3三者在缺氧缺营养条件下的相互调控关系,利用AMPK抑制剂Compound C和PI3K抑制剂LY294002分别抑制AMPK和PI3K的活性,采用Western blot法检测细胞中Gal-3和PI3K的表达量以及AMPK的磷酸化水平。5.明确Gal-3在细胞糖酵解与脂肪酸氧化(FAO)转换关系中的作用为探索在不同培养条件下干扰Gal-3后细胞代谢途径的转化,利用siRNA干扰Gal-3后,采用Western blot法检测细胞内AMPK的磷酸化水平和肉碱棕榈酰转移酶1(CPT1)的表达量,利用NEFA(游离脂肪酸)测定试剂盒检测不同培养环境下细胞内的NEFA水平。为进一步确证干扰Gal-3后TAMs和MDA-MB-231细胞是否通过上调FAO水平来维持生存率以及Gal-3的作用靶点,在正常或缺氧条件下利用Compound C和Etomoxir分别抑制AMPK活化和CPT1酶活,利用MTT法对细胞生存率进行检测。6.探究Gal-3在不同缺氧缺糖浓度及培养时间下参与调控TAMs和MDA-MB-231细胞摄取葡萄糖的分子机制在缺氧缺糖浓度梯度下,采用MTT法检测干扰Gal-3对TAMs和MDA-MB-231细胞生存率的影响;采用葡萄糖测定试剂盒检测干扰Gal-3对细胞葡萄糖摄取的影响;采用免疫荧光法检测细胞内葡萄糖转运蛋白1(GLUT1)的表达量和分布;采用Western blot法检测细胞内Gal-3和PI3K的表达量以及AMPK的活性。为探索Gal-3在葡萄糖浓度为5.6 mM的缺氧低糖条件下调控细胞摄取葡萄糖的具体机制,分别采用Western blot法和免疫荧光法检测加入LY294002或PDTC后对细胞中NF-κB、PI3K、Gal-3和GLUT1蛋白表达的影响;采用葡萄糖测定试剂盒检测加入LY294002或PDTC后对细胞葡萄糖摄取的影响;分别采用Western blot法和免疫荧光法检测干扰掉Gal-3后对细胞中PKM2、AMPK、P-AMPK、CPT1A和GLUT1蛋白表达的影响。为探究代谢相关蛋白在缺氧低糖培养时间梯度下的表达量差异,采用Western blot法对缺氧缺糖培养不同时间下细胞中NF-κB、PI3K、Gal-3、CPT1-A和GLUT1的表达量进行检测。为验证在葡萄糖浓度为5.6 mM的缺氧低糖条件下PI3K和NF-κB对GLUT1和Gal-3的促进作用是否具有时间依赖性,采用Western blot法检测加入LY294002或PDTC在不同培养时间下对细胞中GLUT1和Gal-3蛋白表达的影响。7.检测TAMs条件培养基对MDA-MB-231细胞增殖及糖酵解水平的影响采用干扰或未干扰Gal-3的TAMs条件培养基孵育MDA-MB-231细胞,24小时后检测MDA-MB-231细胞在不同培养条件下的增殖率、葡萄糖摄取、乳酸分泌、乳酸含量和LDH活力的变化。实验结果:1.THP-1细胞向TAMs和M2型巨噬细胞的分化及鉴定RT-PCR结果显示,TAMs和M2型巨噬细胞与THP-1细胞相比,IL-10和IL-1R的mRNA水平明显升高,IL-12和NOS2的mRNA水平明显降低;流式细胞术检测结果显示,诱导分化后的TAMs和M2型巨噬细胞内的CD163和CD68分子均高表达,说明THP-1细胞成功分化为TAMs和M2型巨噬细胞。2.缺氧缺营养细胞模型的建立免疫荧光结果显示缺氧和缺氧缺营养的培养条件均能激活TAMs和MDA-MB-231细胞中的HIF-1α,缺氧模型造模成功。其中缺氧缺糖对细胞的形态影响较大,细胞生长状态最差。3.不同培养条件下干扰Gal-3对细胞生存率及糖酵解水平的影响在正常和缺氧培养条件下,干扰TAMs、M2型巨噬细胞和MDA-MB-231细胞中的Gal-3后,细胞生存率变化不明显;在缺氧缺营养的培养条件下,干扰细胞中的Gal-3后,细胞生存率明显降低。代谢试剂盒检测结果表明,在不同培养条件(除缺糖培养)下,TAMs、M2型巨噬细胞和MDA-MB-231细胞中的Gal-3均可促进细胞内的糖酵解代谢,Gal-3主要通过作用于LDH和PKM2以及增加细胞的葡萄糖摄取量来促进糖酵解途径。4.Gal-3在TAMs和MDA-MB-231细胞中调控代谢途径的分子机制不同极端环境下TAMs和MDA-MB-231细胞内Gal-3的表达显著上调(缺糖时Gal-3表达下调)。TAMs和MDA-MB-231细胞中Gal-3和NF-κB的表达在缺氧缺糖的培养条件下明显降低,而AMPK的磷酸化水平在缺氧缺糖的培养条件下明显升高。TAMs内的PI3K在缺氧缺糖条件下表达量明显升高,而MDA-MB-231细胞内的PI3K在缺氧缺糖条件下表达量明显降低,PI3K在两种一细胞中的表达变化呈现相反趋势。免疫荧光和Western blot结果显示,缺氧缺糖条件下加入AMPK抑制剂Compound C后TAMs和MDA-MB-231细胞中的Gal-3表达和NF-κB活性升高。进一步加入PDTC抑制NF-κB活性后,Gal-3蛋白表达量减少。说明缺氧缺糖可激活TAMs和MDA-MB-231细胞中的AMPK,通过抑制NF-κB的活性来负向调控Gal-3水平。在缺氧缺糖条件下加入AMPK抑制剂Compound C后,TAMs和MDA-MB-231细胞中PI3K和Gal-3的表达量增加;在缺氧缺血清条件下加入AMPK激活剂AICAR后,细胞中Gal-3的表达量减少。在缺氧缺营养条件下应用PI3K抑制剂LY294002后,TAMs和MDA-MB-231细胞中Gal-3的表达量减少,AMPK磷酸化水平升高。在缺氧缺营养条件下,TAMs和MDA-MB-231细胞中的PI3K和AMPK在调控Gal-3上发挥相反作用:PI3K促进Gal-3的表达,而AMPK抑制Gal-3的表达。5.Gal-3在细胞糖酵解与脂肪酸氧化(FAO)转换关系中的作用Western blot和NEFA试剂盒检测结果显示,在正常或缺氧培养条件下,干扰Gal-3后,TAMs和MDA-MB-231细胞内AMPK的磷酸化程度和CPT1-A表达量明显升高,NEFA水平明显降低;在缺氧缺营养条件下,干扰Gal-3后细胞内AMPK的磷酸化和NEFA水平不变。在正常培养或缺氧培养条件下,干扰Gal-3并加入AMPK抑制剂Compound C或FAO抑制剂Etomoxir后,两种细胞生存率降低。在正常或缺氧条件下干扰Gal-3后,TAMs和MDA-MB-231细胞通过激活AMPK和CPT1来进行糖酵解向FAO的代谢转化。6.Gal-3在不同缺氧缺糖浓度及培养时间下促进TAMs和MDA-MB-231细胞摄取葡萄糖的分子机制MTT和葡萄糖摄取实验结果显示,干扰掉Gal-3以后,TAMs和MDA-MB-231细胞的生存率和葡萄糖摄取率在缺氧环境葡萄糖浓度为5.6mM时明显降低。Western blot结果显示随着缺氧环境葡萄糖浓度的降低,TAMs和MDA-MB-231细胞中Gal-3的表达先升高后降低,在葡萄糖浓度为5.6 mM时表达最高;PI3K和GLUT1的表达以及AMPK的活性均在葡萄糖浓度降低为5.6 mM时明显增强。TAMs中PI3K和GLUT1的表达随着缺氧环境葡萄糖浓度的降低逐渐增强,MDA-MB-231细胞中PI3K和GLUT1的表达在葡萄糖浓度低于5.6 mM时降低。Western blot结果显示,在葡萄糖浓度为5.6 mM的缺氧低糖条件下加入LY294002后,TAMs和MDA-MB-231细胞内NF-κB的表达量均明显降低。说明PI3K对NF-κB存在正向调控作用。加入LY294002或PDTC后,TAMs和MDA-MB-231细胞内GLUT1和Gal-3的表达量以及细胞葡萄糖摄取量减少。加入Gal-3 siRNA后,两种细胞内GLUT1的表达量在葡萄糖浓度为5.6 mM时降低。说明TAMs和MDA-MB-231细胞在葡萄糖浓度为5.6 mM的缺氧低糖条件下可通过激活PI3K/NF-κB/Gal-3/GLUT1通路来加速摄取葡萄糖。进一步Western blot结果显示,随着缺氧缺糖时间的延长,加入LY294002和PDTC的细胞中GLUT1和Gal-3表达量的降低幅度逐渐增大。表明PI3K和NF-κB在缺氧低糖条件下可时间依赖性地促进Gal-3和GLUT1的表达。7.TAMs条件培养基对MDA-MB-231细胞增殖及糖酵解水平的影响MTT结果显示,在缺氧缺糖条件下TAMs条件培养基可促进MDA-MB-231细胞的增殖;干扰掉TAMs中的Gal-3后,这种促进作用消失。代谢试剂盒检测结果表明,TAMs条件培养基在正常培养、缺氧培养或缺氧缺血清培养的条件下可明显抑制MDA-MB-231细胞摄取葡萄糖,干扰掉TAMs中的Gal-3后,这种抑制作用被部分抵消。在缺氧或缺氧缺血清的条件下,TAMs产生或分泌Gal-3可促进MDA-MB-231细胞的糖酵解代谢。实验结论1.在缺氧肿瘤微环境中,TAMs和MDA-MB-231细胞内Gal-3高表达,抑制细胞内糖酵解途径向脂肪酸氧化途径的转化,使细胞维持高水平的糖酵解活性;干扰TAMs和MDA-MB-231细胞内的Gal-3后,细胞的主要代谢产能方式由糖酵解向脂肪酸氧化进行转化,以维持细胞生存。2.在缺氧缺糖的肿瘤微环境中,TAMs和MDA-MB-231细胞中的AMPK被明显激活,活化后的AMPK可阻断Gal-3对糖酵解的促进作用并激活细胞内的脂肪酸氧化途径,以替代产能效率较低的糖酵解途径。3.在缺氧缺血清的肿瘤微环境中,TAMs和MDA-MB-231细胞中的PI3K处于高活性状态,正向调控Gal-3的表达。升高的Gal-3水平可促进细胞的糖酵解途径,加速细胞在营养缺乏状态下对葡萄糖的储存利用。4.在环境葡萄糖浓度为5.6 mM的缺氧低糖条件下,TAMs和MDA-MB-231细胞可通过激活PI3K/NF-κB/Gal-3/GLUT1通路来加速摄取葡萄糖。5.TAMs产生或分泌的Gal-3在缺氧缺营养条件下可促进MDA-MB-231细胞的增殖和糖酵解代谢。