研究背景及目的冠状动脉粥样硬化性心脏病(coronary atherosclerotic heart disease, CHD)是冠状动脉粥样硬化导致冠状动脉血管管腔狭窄,或者动脉粥样硬化斑块阻塞冠脉,或(和)因冠状动脉痉挛等功能性改变导致心肌缺血缺氧或坏死而引起的心脏病,是严重危害人类健康的常见病。心肌梗死(myocardial infarction, MI)是指心肌缺血性坏死,是在冠状动脉病变的基础上发生的冠状动脉血供急剧减少或中断,导致相应心肌严重而持久急性缺血出现心肌坏死；是冠心病急性冠脉综合征严重类型。本病病死率高,我国本病发病率也在逐年增多。近年来,溶栓、经皮冠状动脉介入治疗(percutaneous coronary intervention, PCI).主动脉-冠状动脉旁路移植术(coronary artery bypass grafting, CABG)得到广泛应用,使闭塞的冠状动脉再通,缺血缺氧的心肌得到血液再灌注,濒临坏死的心肌细胞得以存活,缩小梗死面积,减轻心肌重塑,改善了患者预后,挽救了许多急性心肌梗死患者的生命。然而研究发现缺血后再灌注有时不仅不能改善病情,反而加重功能结构损伤。这种在缺血基础上恢复血流后组织损伤反而加重,甚至发生不可逆损伤的现象称为缺血再灌注损伤(ischemia reperfusion injury, IR).如何做到既尽早恢复缺血组织血流,又不发生再灌注损伤,是缺血性疾病防治中亟待解决的重要课题。龙牙楤木为五加科楤木属植物,主要分布于我国东北地区,资源丰富；其根茎皮叶性平味辛有小毒,具有祛风除湿,健胃利水,活血止痛,补气安神,强精滋肾之功效。现代研究表明龙牙楤木总皂苷(Aralsides, Ar)具有抗氧化、抗心肌缺血、保护心肌作用。已有研究证明龙牙惚木提取物通过提高抗氧化酶活性,减少自由基的生成,稳定线粒体内游离Ca2+浓度对线粒体产生保护作用。龙牙楤木总皂苷的心肌保护作用机制则可能是通过增加SOD的活力,对抗氧自由基对心肌细胞的毒害作用,从而减轻心肌细胞的损伤。综上,龙牙楤木总皂苷通过增强细胞抗氧化作用,减少自由基及脂质过氧化物导致的细胞膜损伤等机制起到保护心肌缺血再灌注损伤的作用。与研究其他中药抗心肌缺血再灌注损伤机理寻找多个作用靶点一样,我们也需要通过研究龙牙楤木总皂苷对缺血再灌注心肌的保护作理,明确是否龙牙楤木总皂苷的作用机制也存在多个作用靶点。线粒体是细胞氧化磷酸化反应发生的重要场所,参与自由基生成、钙超载等环节,在心肌缺血再灌注损伤中,线粒体结构和功能都会受到不同程度的损伤。近年来研究发现,线粒体内膜上存在三磷酸腺苷敏感性钾通道(mitoKATP),对生物膜的稳定性、线粒体及心肌细胞的功能起着非常重要的作用,开放ATP敏感性钾通道具有保护缺血再灌注心肌的作用,因此心肌细胞线粒体三磷酸腺苷敏感性钾通道(mitochondria ATP-sensiive potassium, mitoKATP)是心肌缺血再灌注损伤的重要治疗靶点。本课题旨在探讨龙牙楤木总皂苷对心肌细胞线粒体三磷酸腺苷敏感性钾通道(mitoKATP)是否具有正性作用,进而提出假说：龙牙楤木总皂苷通过开放线粒体敏感性钾通道,调节线粒体膜电位、减少线粒体形态、结构和功能的损伤,促进线粒体呼吸功能的恢复,减少ATP的水解,进而促进能量物质的合成,稳定心肌细胞细胞膜,减轻心肌缺血再灌注损伤。本论文分文献综述和实验研究两部分。文献综述部分包括Langendroff离体心脏逆行灌流方法的沿革及应用、与mitoKATP通道相关的心血管离子通道药理学研究、冠心病的中医药临床治疗和研究进展和龙牙楤木总皂苷药物化学成分和药理学研究进展四部分。Langendroff离体心脏逆行灌流方法是本实验的基础造模方法,综述一从离体心脏灌流的发明、逆行灌流的原理、原则、恒压恒流两种不同的灌流模式、实验必要条件、生理学参数的测量、可能出现的误区、实验的设计与特殊应用等方面,全面回顾了该方法的规范化流程、优缺点及使用注意事项。综述二从电生理学的发展沿革、离子通道的概念、生理结构、生理特征、分类、药物作用于离子通道的作用机理、KATP的分类、分布、生理学作用、药理学特点、相关疾病等方面系统总结了与KATP通道相关的心血管离子通道药理学研究。综述三回顾了传统中医学对冠心病、心肌缺血再灌注损伤病因病机、辨证论治的认识过程,总结了中西医结合医学对冠心病、心肌缺血再灌注损伤诊断和治疗的研究进展,概述了中药复方、单味中药、中药提取单体对心肌缺血再灌注损伤的作用研究进展,提示中医药对心肌缺血再灌注损伤的防治具有良好的应用前景。综述四是龙牙楤木总皂苷药物化学成分和药理学研究进展。实验研究部分目的：(1)探索大鼠急性心肌梗死模型缺血再灌注损伤心肌保护问题；明确心肌细胞线粒体ATP敏感性钾通道与缺血再灌注损伤的关系；(2)观察龙牙楤木总皂苷对心肌细胞线粒体ATP敏感性钾通道的开放作用；(3)阐明龙牙楤木总皂苷抗心肌细胞缺血再灌注损伤的机制。方法：使用Langendroff离体心脏逆行灌流系统建立大鼠离体心脏灌流模型,对照组(假手术组)以K-H液行常规恒压持续平衡灌注125min；同对照组平衡20min后模型组结扎冠状动脉左前降支靠近分支处停灌(缺血)30min后K-H液复灌(再灌注)75min；二氮嗪(Diazoxide, DZ)组处理同模型组,复灌时以含50umol/LDZ的改良K-H液复灌75min；龙牙楤木总皂苷组处理同模型组,复灌时以含5mg/L龙牙楤木总皂苷的改良K-H液复灌75min；5-羟基癸酸组(5-hydroxydecanoate,5-HD)处理同模型组,复灌时以含100umol/L的5-HD的改良K-H液复灌75min;5-HD加龙牙穗木总皂苷组处理同模型组,复灌时先行给予100umol/L的5-HD的改良K-H液复灌15min,再以含50mg/ml龙牙楤木总皂苷的改良K-H液复灌60min。伊文思蓝、TTC染色观察心肌梗死、缺血面积；记录左心室压力及心率变化过程,比较各组平衡20min、局部缺血30min、再灌15min、再灌30min、再灌75min的血流动力学指标及灌流液中肌酸激酶(creatine kinase, CK)和乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)漏出量。各组经以上处理后,分别切取心尖部心肌2块,分别用以制备透射电镜标本观察心肌超微结构和心肌细胞线粒体超微结构、提取线粒体用罗丹明-123(Rhodamine123, R-123)染色以流式细胞仪检测线粒体膜电位。结果：益气活血中药提取物龙牙楤木总皂苷与mitoKATP开放剂DZ有类同的作用,可以减少大鼠心肌缺血再灌注损伤过程中心肌酶、乳酸脱氢酶的释放、改善血流动力学、改善心律、保护心肌细胞和心肌细胞线粒体的结构和功能,维持缺血再灌注损伤过程中心肌细胞线粒体的膜电位。而一些作用大部分可被mitoKATP阻滞剂5-HD解除。结论：龙牙楤木总皂苷可以增强再灌注过程中心脏舒缩功能,减少心肌细胞心肌酶的漏出,保护心肌纤维、心肌细胞和线粒体的结构形态,稳定线粒体膜电位,保护线粒体的功能；这些作用都与mitoKATP通道开放剂DZ类同,且都可被mitoKATP通道阻滞剂5-HD取消,可以认为是通过mitoKATP通道起作用的。