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乳腺炎是奶牛最为常见的疾病之一,发病率高、难诊断且治疗困难,严重影响奶牛业的发展。研究显示诱发奶牛乳腺炎最常见的病原微生物是金黄色葡萄球菌和大肠杆菌。奶牛乳腺上皮细胞在抵御金黄色葡萄球菌和大肠杆菌感染过程中发挥重要作用,其通过介导Toll样受体、MAPK、细胞凋亡等信号通路的调节,分泌炎性因子、趋化因子等多种细胞因子,参与免疫应答。m6A甲基化（N6-methyladenosine methylation）是一种在细菌和真核生物中广泛存在的RNA修饰,其通过“writers”、“easers”、“readers”等酶的作用在多种疾病的发生发展中发挥重要功能,并动态调节该进程。m6A甲基化修饰在奶牛乳腺炎中的作用及机制尚不清楚。本研究通过建立金黄色葡萄球菌/大肠杆菌诱导的奶牛乳腺上皮细胞炎症模型,绘制了奶牛乳腺上皮细胞m6A甲基化修饰谱,鉴定了发生差异甲基化的TLR4分子;进一步筛选获得差异去甲基化酶ALKBH5;沉默及过表达ALKBH5,并对所介导的TLR4 m6A变化进行分析,阐明ALKBH5介导TLR4 m6A调控乳腺上皮细胞炎症反应的分子机制,为研究m6A甲基化在防控奶牛乳腺炎中的作用奠定了基础。主要研究结果如下:1.奶牛乳腺上皮细胞体外炎症模型的建立将S.aureus/E.coli增菌培养并灭活,以感染比10:1诱导MAC-T细胞,24 h后分别收集细胞及上清,通过RT-qPCR及ELISA检测炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α的表达,发现炎性因子的表达量显著上升（p<0.05）;利用RT-qPCR及WB检测发现TLR4的mRNA及蛋白水平显著上升;利用流式细胞术检测细胞凋亡率,发现金黄色葡萄球菌组及大肠杆组的细胞凋亡情况显著高于对照组。这些实验结果表明体外感染模型建立成功。2.奶牛乳腺上皮细胞甲基化修饰酶的差异表达分析在前述模型基础上,分别检测了m6A修饰的甲基化转移酶METTL3、METTL14、WTAP及去甲基化酶FTO、ALKBH5的mRNA表达,发现METTL3、METTL14、WTAP、ALKBH5的mRNA表达水平在S.aureus/E.coli感染的MAC-T细胞中呈现不同程度的升高（p<0.05）,而FTO的mRNA表达水平在S.aureus/E.coli感染的MAC-T细胞中未见明显差异（p>0.05）。3.奶牛乳腺上皮细胞m6A甲基化修饰谱的绘制及分析对灭活的S.aureus/E.coli诱导的奶牛乳腺上皮细胞开展MeRIP-seq分析。在金黄色葡萄球菌处理组中,在844个mRNA中共发现1006个差异显著的m6A甲基化峰;大肠杆菌处理组中,在2101个mRNA中共发现了2904个差异显著的m6A甲基化峰。此外,本研究还对S.aureus组和E.coli组中的差异m6A甲基化峰进行了比较分析,在S.aureus组和E.coli组中有18个mRNA的m6A峰均为高甲基化,有390个mRNA的m6A峰均为低甲基化。生物信息学分析发现发生差异m6A甲基化修饰的mRNA主要富集在TGF-β信号通路、NF-κB信号通路、hippo信号通路、MAPK信号通路等。MeRIP-seq与mRNA-seq联合分析发现,在金黄色葡萄球菌处理组中有61个mRNA、大肠杆菌处理组中有212个mRNA,其表达可能与m6A修饰有关。4.TLR4的筛选与鉴定根据m6A甲基化修饰谱测序数据,对含有差异m6A甲基化峰的mRNA进行筛选,发现TLR4分子为S.aureus组与E.coli组中均发生显著低m6A修饰的mRNA。利用IGV软件对测序数据中的TLR4 m6A甲基化位点进行可视化分析,并通过MeRIP-qPCR技术证实TLR4分子在S.aureus组及E.coli组中的m6A甲基化水平均显著降低（p<0.05）。5.ALKBH5介导TLR4的m6A甲基化调控牛乳腺上皮细胞炎症反应本研究进一步深入分析获得的MeRIP-seq数据,发现TLR4分子的m6A修饰在S.aureus/E.coli感染的MAC-T细胞中均发生下调,同时依据前期对去甲基化酶的mRNA的验证,推测ALKBH5是使TLR4发生m6A变化的去甲基化酶。本研究使用MeRIP-qPCR、siRNA干扰技术、过表达载体的构建及RT-qPCR、Western Blot等实验方法进行验证。研究结果如下:（1）过表达ALKBH5能导致TLR4的m6A水平、mRNA水平、蛋白水平下调（p<0.05）,沉默ALKBH5能导致TLR4的m6A水平、mRNA水平、蛋白水平上调（p<0.05）,证明ALKBH5能够影响TLR4的m6A水平、mRNA及蛋白的变化;（2）过表达ALKBH5能导致MAPK/NF-κB信号通路中关键分子JNK、ERK、p38、p65的mRNA水平及磷酸化蛋白水平下调（p<0.05）;沉默ALKBH5能导致MAPK/NF-κB信号通路中关键分子JNK、ERK、p38、p65的mRNA水平及磷酸化蛋白水平上调（p<0.05）,证明了ALKBH5能够通过TLR4介导MAPK/NF-κB信号通路;（3）过表达ALKBH5能导致炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α的mRNA水平及蛋白水平下调（p<0.05）;沉默ALKBH5能导致炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α的mRNA水平及蛋白水平上调（p<0.05）,证明ALKBH5通过介导TLR4/MAPK/NF-κB,调节炎性因子的释放。综上所述,本研究发现了在S.aureus/E.coli感染的MAC-T细胞中m6A甲基化相关酶的表达变化,同时也发现金黄色葡萄球菌组1006个差异显著m6A甲基化峰,大肠杆菌感染组中2904个差异显著的m6A甲基化峰。本研究还证实了ALKBH5通过调节TLR4的m6A甲基化水平、mRNA及蛋白的表达,进而介导MAPK/NF-κB信号通路,最终影响了炎性因子的表达与释放,该研究为后续对于奶牛乳腺的m6A机制研究奠定了基础。