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脊髓性肌肉萎缩(Spinal muscular atrophy, SMA)是指一类由于脊髓前角运动神经元(Anterior horn cells of the spinal cord)缺失而导致的进行性骨骼肌无力和萎缩的一组神经变性疾病。该疾病主要是由于运动神经元存活(Survival motor neuron1, SMN1)基因缺失或突变造成运动神经元蛋白的缺失或功能丧失所致。目前临床上尚无有效的治疗方法。人的SMN1基因在每条5号染色体长臂1区3带,SMN2与SMN1高度同源,二者在外显子上仅存在两个碱基的差别。SMN2存在于所有的SMA病人中。本研究联合利用类转录激活效应因子核酸酶(transcription activator like effector nucleases, TALEN)技术对病人特异性的诱导性多潜能干细胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs)的SMN2基因进行定点打靶,使SMN2基因定点诱变成类SMN1基因,表达出完整的SMN蛋白,行使其功能,从而实现对SMA的自体化基因治疗。一、SMA病人特异性iPSCs的诱导目的：利用SMA病人来源的尿液细胞诱导SMA病人特异性的iPS细胞方法：利用逆转录病毒将四种转录因子Oct4, Sox2, c-Myc和Klf4导入SMA患者来源的尿液细胞中,在VPA的作用下,获得SMA病人特异性的iPSCs。通过细胞形态学、核型分析、碱性磷酸酶染色、干细胞表面标志物检测及体内分化实验对其进行鉴定。结果：(1)免疫荧光检测显示诱导产生的SMA-iPSCs干细胞表面标志物表达情况与正常ESCs一致,碱性磷酸酶染色呈阳性；(2)对诱导后传至P15代的SMA-iPSCs行核型检测显示诱导后细胞没有发生染色体水平的突变,检测结果同该病人外周血检测结果一致。结论：本研究成功将SMA病人来源的尿液细胞诱导为病人特异性的iPSCs,初步鉴定结果显示该病人特异性的iPSCs具有干细胞特性。二、SMA非病毒基因治疗载体的构建与打靶目的：构建定点诱变载体pMN-Neo,该载体定点靶向SMN2基因,联合TALEN技术将pMN-Neo定点靶入SMA-iPSCs的SMN2基因7、8号外显子区,筛选获得表达SMN蛋白的克隆。方法：1.通过PCR扩增,酶切,连接等分子技术构建载体pMN,再在载体pMN中加入Neo筛选基因的完整表达框获得载体pMN-Neo;2.采用单细胞核转染的方式转染单细胞化的SMA-iPSCs。结果：1.通过Nhe Ⅰ酶切,测序等方法鉴定,显示所构建的打靶载体pMN-Neo与预期理论一致；2.pMN-Neo核转SMA-iPSCs中,经G418筛选13天获得122个克隆。结论：成功构建TALEN和定点诱变载体pMN-Neo,初步获得待鉴定SMA病人特异性的iPS打靶细胞系。