背景近年来,越来越多的研究发现女性糖尿病人群中乳腺癌患病率较非糖尿病人群增加,提示糖尿病是引起乳腺癌发病的危险因素之一。糖尿病患者长期持续血糖升高造成机体内环境紊乱,导致低度炎症状态、低脂联素(APN)水平,这些都可能与乳腺癌发生风险增高相关。临床研究发现,血清脂联素的水平和恶性肿瘤发生发展呈负相关;干预乳腺癌细胞的相关研究也发现脂联素可以通过多种通路抑制乳腺癌细胞的增殖,诱导乳腺癌细胞凋亡,从而参与糖尿病或肥胖患者罹患乳腺癌的机制。除了凋亡和坏死外,包括肿瘤细胞在内的真核细胞还会发生另一种细胞死亡过程即自噬(Autophagy),胞浆内的细胞器和功能蛋白在应激情况下,出现自我消化降解,最终导致细胞的程序性死亡。自噬的过度诱导可以造成肿瘤细胞的死亡,即“自噬性死亡”;因此,自噬被认为是预防和治疗肿瘤的重要靶点。微管相关蛋白l轻链3(LC3)是一种与自噬过程有关的重要蛋白,分为LC3A、LC3B、LC3C 3种亚型,其中只有LC3B与自噬相关,在自噬研究中一般用LC3代表LC3B,该蛋白的表达情况可以反映自噬状态,它在体内分为有活性的LC3-II和无活性的LC3-I,通常用LC3-II/LC3-I比值预测自噬流的形成和自噬水平高低。虽然前期研究发现低脂联素水平是2型糖尿病患者乳腺癌发生风险增高的重要因素,脂联素可能促进乳腺癌MCF-7细胞自噬,但脂联素和自噬相关蛋白LC3在糖尿病患者乳腺癌组织中的表达是否存在必然联系、脂联素促乳腺癌细胞自噬可能通过何种信号通路介导,还并不清楚。目的1.研究2型糖尿病伴乳腺癌患者乳腺癌组织中APN和LC3的表达,探讨两者间的相关性及其临床意义。2.研究全长脂联素(Acrp30)对高糖环境下培养的人乳腺癌MCF-7细胞生长、凋亡和自噬的影响,以及脂联素是否通过NF-κB信号通路影响乳腺癌MCF-7细胞自噬,从而为干预2型糖尿病罹患乳腺癌风险及治疗提供更为明确的依据。方法第一部分:1.纳入48例合并2型糖尿病并经手术证实的乳腺癌患者作为糖尿病组,53例非糖尿病的乳腺癌患者为对照组。2.采集研究对象临床和病理学资料,生化仪检测重要的生化指标,ELISA法检测血清脂联素。3.Real-time RT-PCR法检测2组乳腺癌组织中APN、LC3的m RNA表达。4.免疫组织化学法检测2组乳腺癌组织中APN、LC3的表达,分析脂联素与2型糖尿病患者乳腺癌组织自噬相关蛋白的表达是否存在相关性。第二部分:1.体外模拟高血糖状态,在高糖环境中培养人乳腺癌MCF-7细胞,并按Acrp30的干预浓度分组(25、50、100、200 ng/ml),分别干预24小时和48小时,未加脂联素的MCF-7细胞做为对照组。1)倒置显微镜观察各组细胞生长状态;2)MTT法测定各组细胞增值活力和生长抑制率;3)流式细胞仪Annexin V-FITC法检测总细胞凋亡率;4)Western blot法检测上述组LC3、NF-κB蛋白表达。2.选择特异性NF-κB信号转导通路激活剂佛波醇酯(丙二醇甲醚醋酸酯,PMA)、抑制剂二硫代氨基甲酸吡咯烷(PDTC)以及Acrp30作为分组因素,培养的细胞分为对照组、Acrp30组、PMA组、PMA+Acrp30组、PDTC组以及PDTC+Acrp30组六组;分别干预MCF-7细胞,Western blot法检测各组NF-κB,LC3蛋白表达,分析脂联素可能的促自噬作用是否与抑制NF-κB信号通路有关。结果第一部分:1.两组血清脂联素、临床生化指标及病理特征比较糖尿病组患者空腹血糖(FBG,P<0.01)、糖化血红蛋白(Hb A1C,P<0.01)、甘油三酯(TG,P<0.05)均高于对照组,血清脂联素水平低于对照组(P<0.05);糖尿病组肿瘤直径>2 cm发现率高于对照组(P<0.05);糖尿病组淋巴结转移率高于对照组(P<0.05);两组在年龄、月经状况、BMI、WHR、TCH、组织学分级等方面差异无统计学意义(P>0.05)。2.Real-time RT-PCR法检测比较两组乳腺癌组织APN与LC3 m RNA的表达糖尿病组ΔCt APN m RNA(9.18±0.79),对照组ΔCt APN m RNA(4.78±0.71);糖尿病组ΔCt LC3 m RNA(8.57±0.39),对照组ΔCt LC3 m RNA(5.07±0.22)。ΔCt值越高提示表达量越低,糖尿病组乳腺癌组织APN和LC3 m RNA相对表达量均低于对照组(P<0.05)。乳腺癌组织中APN和LC3 m RNA表达水平呈正相关(r=0.518,P<0.05)。3.免疫组化法检测比较两组乳腺癌组织中APN及LC3的表达阳性反应产物主要位于乳腺癌细胞的胞浆中,呈黄色或棕黄色的染色颗粒。糖尿病组乳腺癌组织的APN的表达阳性率仅为18.8%,低于对照组的35.9%(P<0.05);LC3蛋白表达阳性率仅为14.5%,低于对照组的32.0%(P<0.05)。4.乳腺癌组织中APN与LC3蛋白表达的相关性(1)糖尿病组:APN阴性组中LC3阴性率为89.7%(35/39),APN阳性组中LC3阴性率为66.7%(6/9)。APN阴性组LC3的表达阴性率高,APN阴性组LC3的表达明显低于APN阳性组,两者比较差异有统计学意义(P<0.01),APN与LC3的表达呈正相关。(2)对照组:APN阴性组中LC3阴性率为76.4%(26/34),APN阳性组中LC3阴性率为52.6%(10/19)。APN阴性组LC3的表达阴性率高,APN阴性组LC3的表达明显低于APN阳性组,两者比较差异有统计学意义(P<0.05),APN与LC3的表达呈正相关。第二部分:1.倒置显微镜观察各组细胞生长Acrp30干预48小时后细胞体积逐渐缩小,活细胞数减少,漂浮细胞增多,细胞生长受抑制。2.MTT法测定不同浓度Acrp30干预MCF-7细胞24、48小时后各组细胞增殖活性(1)细胞增殖结果。干预24小时后,与对照组相比,25、50ng/ml组OD490nm值降低但差异无统计学意义;100、200 ng/ml组OD490nm值较对照组显著降低(P<0.01~0.05)。48小时后,与对照组相比,25ng/ml组OD490nm值差异无统计学意义;50、100、200 ng/ml组OD490nm值显著降低(P<0.01~0.05)。不同浓度组OD490nm值逐渐降低,组间差异具有统计学意义(P<0.01)。(2)细胞生长抑制率结果。干预24小时、48小时后,与25ng/ml组相比,50、100、200ng/ml组的生长抑制率升高(P<0.01~0.05);与50ng/ml组相比,100、200ng/ml组的生长抑制率升高(P<0.01);与100ng/ml组相比,200ng/ml组的生长抑制率升高(P<0.01)。48h组较24h组抑制率升高。Acrp30可以降低MCF-7细胞活性,抑制细胞生长,抑制作用呈剂量-时间依赖性关系。3.流式细胞仪Annexin V-FITC法检测总细胞凋亡率(1)Acrp30干预24小时后,与对照组相比,4个试验组细胞凋亡率随分组浓度逐渐升高,但差异无统计学意义(P>0.05)。(2)48小时后,与对照组相比,25、50 ng/ml组凋亡率无明显变化(P>0.05),100、200 ng/ml组凋亡率显著升高(P<0.01);200ng/ml组的凋亡率高于100ng/ml组(P<0.01),各组间差异有统计学意义(P<0.01)。48h组较24h组凋亡率升高。Acrp30可以促MCF-7细胞凋亡,该作用呈剂量-时间依赖性关系。4.Western blot检测不同浓度Acrp30干预后NF-κB和LC3-II/LC3-I表达(1)干预24小时后,与对照组相比,25、50ng/ml组NF-κB表达降低,但差异无统计学意义(P>0.05),100、200ng/ml组NF-κB表达显著降低(P<0.05),100、200ng/ml两组间差异无统计学意义(P>0.05)。48小时后,与对照组相比,25ng/ml组NF-κB表达降低,但差异无统计学意义(P>0.05),50、100、200ng/ml组NF-κB表达显著降低(P<0.01~0.05),且三组NF-κB表达逐渐降低,组间差异有统计学意义(P<0.05)。与24h相比,48h组50、100、200ng/ml浓度下NF-κB表达降低程度更明显。(2)干预24小时后,与对照组相比,25、50ng/ml组LC3-II/LC3-I升高但差异无统计学意义(P>0.05),100ng/ml、200ng/ml组LC3-II/LC3-I明显升高(P<0.05)。48小时后,与对照组相比,25ng/ml组LC3-II/LC3-I升高但差异无统计学意义(P>0.05),50、100、200ng/ml组LC3-II/LC3-I水平明显升高(P<0.05);100、200ng/ml两组LC3-II/LC3-I水平较50ng/ml组升高且差异有统计学意义(P<0.05),100、200ng/ml两组间差异无统计学意义(P>0.05)。与干预24h相比,48h组50、100ng/ml浓度下LC3-II/LC3-I水平增加更明显。5.Western blot检测NF-κB通路活化剂PMA、抑制剂PDTC及Acrp30分组干预后NF-κB和LC3-II/LC3-I表达(1)活化剂PMA干预后:1)与对照组相比:PMA组NF-κB表达显著升高(P<0.01),LC3-II/LC3-I轻度降低(P>0.05);PMA+Acrp30组NF-κB表达轻度下降(P>0.05),LC3-II/LC3-I表达显著升高(P<0.01);2)组间比较:PMA、PMA+Acrp30、Acrp30三组NF-κB逐渐降低,LC3-II/LC3-I表达量逐渐升高,三组间差异有统计学意义(P<0.01~0.05)。说明PMA活化NF-κB通路后,NF-κB表达上升,再予Acrp30仍然能抑制NF-κB通路,最终增加细胞自噬水平,自噬水平较未用PMA干预要低。(2)抑制剂PDTC干预后:PDTC、PDTC+Acrp30、Acrp30三组NF-κB表达较对照组显著降低(P<0.05),但三组间差异无统计学意义(P>0.05);PDTC组、PDTC+Acrp30组LC3II/LC3I表达量较对照组升高(P>0.05),但两组间差异无统计学意义(P>0.05);Acrp30组较PDTC、PDTC+Acrp30组LC3II/LC3I表达增加且差异有统计学意义(P<0.01)。说明PDTC抑制NF-κB通路后,NF-κB表达下降,自噬水平增加;再予Acrp30干预,由于通路阻断,自噬水平无明显变化。结论1.2型糖尿病合并乳腺癌患者较非糖尿病者血清脂联素水平降低,2型糖尿病者乳腺癌组织脂联素APN和自噬相关蛋白LB3的表达较非糖尿病者降低,且两者呈正相关。2.脂联素抑制高糖环境培养下人乳腺癌MCF-7细胞株的生长状态,抑制细胞增殖同时促进肿瘤细胞凋亡,上述效应呈浓度-时间依赖关系。3.脂联素抑制高糖环境下MCF-7细胞NF-κB蛋白表达,增加细胞自噬水平LC3-II/LC3-I,上述效应呈浓度-时间依赖关系。4.脂联素可以通过抑制NF-κB通路,降低NF-κB表达,削减其对自噬的抑制,最终诱导MCF-7细胞自噬增强。