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猪星状病毒(Porcine astroviruses,PAstVs)是星状病毒科哺乳动物属内的无囊膜单股正链RNA病毒,是引发仔猪腹泻、脱水及食欲下降等肠道疾病的重要病原。星状病毒基因重组、跨物种传播及适应新宿主的能力使星状病毒成为潜在的人畜共患病原。了解星状病毒的遗传进化特征及研制安全有效的疫苗对于防控星状病毒感染意义重大。本课题的主要研究结果如下:1.猪星状病毒的全基因组克隆及其遗传进化特征分析:通过RT-PCR在天津静海、宁河养殖场的29份猪腹泻粪便中检测到PAstV2(3份)和PAstV4(1份),PAstV检出率为13.8%。通过四节段重叠PCR和RACE方法克隆了PAstV4全基因组序列,将其命名为PAstV4/Tianjin/2018。核苷酸序列分析结果显示PAstV4/Tianjin/2018基因组包含典型的星状病毒科核苷酸基序,核糖体移位信号和高度保守的亚基因组启动子序列位于ORF1a/1b和ORF1ab/2重叠区内。遗传进化分析表明PAstV4/Tianjin/2018属于PAstV4亚型,与匈牙利株(WBAstV-1/HUN/2011)进化关系最近。基因重组结果显示PAstV4/Tianjin/2018是美国株PAstV4/US-IL135(JX556692.1)和日本株PAstV4/JPN(LC201608.1)的重组毒株,重组位点在ORF1ab/ORF2交界处。2.不同启动子调控的、高效展示Aga1酿酒酵母宿主菌的构建:以酿酒酵母菌株JDY52为出发菌株,通过醋酸锂转化法将线性化质粒PIU211转入JDY52,利用SD-URA选择性培养基和基因组PCR筛选阳性转化子,获得诱导型乳糖启动子LAC调控的、表面高效展示Aga1酵母宿主菌株ST1814A。PCR克隆GPD启动子,通过反向PCR扩增和无缝连接将PIU211 LAC启动子替换为GPD启动子,获得组成型葡萄糖启动子GPD调控的、表面高效展示Aga1酵母宿主菌株ST1814G。3.猪星状病毒Cap蛋白表面展示酿酒酵母表达菌株的构建:以PAstV4/Tianjin/2018 Cap蛋白作为酿酒酵母表面展示蛋白,应用Yeast Fab模块组装方法构建了GAL1启动子、GPD启动子控制的Aga2-Cap转录单位(GAL1-Aga2-Cap-ADH1、GPD-Aga2-Cap-ADH1)。依据酵母同源重组原理通过醋酸锂转化法将Aga2-Cap代谢途径(URR1-TU-LEU2-URR2)整合至ST1814A和ST1814G Ⅳ染色体HO基因座(URR1-HIS3-URR2),通过SD-LEU选择性培养基和基因组PCR鉴定阳性重组子,获得猪星状病毒Cap蛋白表面展示酿酒酵母表达菌株ST1814G/Cap和ST1814A/Cap。4.猪星状病毒Cap蛋白表面展示酿酒酵母菌株表达特征及免疫效力分析:利用Western-blot和免疫荧光分析确定Cap蛋白成功表达且表达在酿酒酵母细胞表面。生长曲线分析表明Cap蛋白的表达不影响重组酿酒酵母的生长。通过ELISA检测口服免疫小鼠的血清IgG和粪便IgA抗体变化,结果表明实验组小鼠的血清Cap特异性IgG和粪便Cap特异性IgA抗体水平显著高于空白菌株组和PBS组。综上所述,本研究成功克隆了猪星状病毒4型天津分离株的全基因组序列,确定了其核苷酸序列及遗传进化特征。构建了不同启动子调控的、表面高效展示Aga1酿酒酵母宿主菌株,可作为外源蛋白肽的表达、递送工具。制备了猪星状病毒Cap蛋白表面展示酿酒酵母工程菌株,为猪星状病毒的免疫防控提供了对策。