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胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一,表现为进展快、生存期短、预后较差。如何提高胃癌的生存率仍是目前临床面临的一大挑战。肿瘤的生长、转移和预后均与血管生成相关。肿瘤血管生成是一个多因子参与的多步骤过程,阻断其中任何一步,都将阻止肿瘤血管生成,因此肿瘤的血管生成系统已成为一个崭新的抗肿瘤治疗靶点。近年来大量研究证实褪黑素具有抗肿瘤作用,其中核受体可能是其发挥抗瘤作用的重要途径。而褪黑素与褪黑素核受体、胃癌血管生成三者之间直接联系的研究尚未见公开报道。本研究旨在探讨乏氧条件下,褪黑素抑制胃癌血管生成及其与褪黑素核受体的关系及相关机制,从而为胃癌的生物学治疗提供新的思路和途径,为应用开发奠定一定基础。1.褪黑素体外抗人胃癌细胞血管生成作用及其对褪黑素核受体的影响为研究褪黑素体外抗人胃癌细胞血管生成作用及其对褪黑素核受体的影响,本部分研究建立不同浓度时间点褪黑素对人胃癌细胞株干预模型,CCK-8、ELISA、实时荧光定量RT-PCR、免疫印迹等方法检测人胃癌细胞增殖活性及VEGF、Angiopoietin、Angiostatin、褪黑素核受体m RNA与蛋白表达的变化。结果显示:(1)褪黑素抑制人胃癌细胞MGC-803、SGC-7901、AGS增殖,呈时间剂量依赖性,100μmol/L氯化钴(Cobalt Chloride,Co Cl2)模拟的化学性低氧可促进人胃癌细胞SGC-7901增殖;(2)高浓度褪黑素可下调人胃癌细胞SGC-7901VEGF m RNA与蛋白表达表达;(3)高浓度褪黑素可下调人胃癌细胞SGC-7901核受体RZR/RORγ表达。2.褪黑素体外抗人胃癌细胞SGC-7901血管生成机制及褪黑素核受体RZR/RORγ作用靶点研究为研究褪黑素体外抑制人胃癌细胞SGC-7901血管生成的可能机制,本部分研究建立乏氧条件下3 m M浓度褪黑素干预24h对人胃癌细胞SGC-7901的体外模型,反义核酸技术(si RNA)沉默核受体RZR/RORγ,观测对细胞增殖活性的影响;实时荧光定量RT-PCR、免疫印迹法检测SGC-7901细胞核受体RZR/RORγ、SENP1、HIF-1α、VEGF m RNA及蛋白表达;利用si RNA技术沉默核受体RZR/RORγ表达探讨SENP1、HIF-1α、VEGF信号通路在褪黑素抑制人胃癌细胞SGC-7901细胞血管生成中的作用。结果发现:(1)应用si RNA技术沉默核受体ROR/RZRγ能明显拮抗褪黑素对人胃癌细胞SGC-7901增殖的抑制作用,提示褪黑素抑制肿瘤细胞增殖与褪黑素核受体RZR/RORγ有关;(2)乏氧条件下,3 m M浓度褪黑素干预24h后明显下调SGC-7901核受体RZR/RORγ表达,并下调SENP1、HIF-1α、VEGF m RNA及蛋白表达;(3)沉默核受体RZR/RORγ可部份上调SENP1、HIF-1α、VEGF m RNA及蛋白表达,提示褪黑素可能通过核受体RZR/RORγ抑制胃癌血管生成。3.褪黑素体内抗荷胃癌祼鼠血管生成影响及其核受体机制为研究褪黑素体内抗荷胃癌祼鼠血管生成作用及其与核受体RZR/RORγ的关系,本部分研究应用人胃癌细胞SGC-7901建立荷胃癌祼鼠模型,不同浓度褪黑素干预后,运用免疫组化、实时荧光定量RT-PCR、免疫印迹等方法检测相关因子的表达变化。结果发现:(1)褪黑素能够缩小荷胃癌祼鼠的肿瘤体积,减轻肿瘤重量,达到抗肿瘤作用;(2)褪黑素在抑制肿瘤生长过程中下调肿瘤组织核受体RZR/RORγ表达并下调SENP1、HIF-1α、VEGF、MVD表达,抑制肿瘤血管生成影响肿瘤增殖;(3)褪黑素下调肿瘤组织核受体RZR/RORγ表达,表明褪黑素可能通过核受体RZR/RORγ途径实现抗荷胃癌祼鼠移植瘤血管生成从而抑制肿瘤生长的作用。综上所述,体内外实验证实褪黑素能够抑制人胃癌细胞SGC-7901血管生成作用,其机制包括通过下调核受体RZR/RORγ表达,并通过核受体RZR/RORγ抑制SENP1、HIF-1α、VEGF表达,从而抑制肿瘤血管生成,抑制肿瘤细胞生长。