原发性胆汁性肝硬化（primary biliary cirrhosis, PBC）是一种以肝内胆管上皮细胞损伤为主要特征的慢性、自身免疫性、胆汁淤积性肝病。该病以中老年女性多发，病因和发病机制尚不完全清楚。大量证据表明，PBC是以遗传为基础，由遗传和环境相互作用而产生的。一些临床和流行病学研究提示，泌尿道感染等因素可能与PBC的发病密切相关，是PBC发病的危险因素，但现有的研究结果并不完全一致，甚至个别研究的结果截然相反。因此，关于泌尿道感染与PBC的关系有待进一步确认。毫无疑问，大多数PBC最终会发展成为肝纤维化和肝硬化，但能否进展成为肝癌，或者说PBC患者肝癌的患病风险是否较一般人群显著升高尚存在很大争议。其原因主要是个体研究的方法学、样本数量、统计效能等问题。循证医学研究可以对当前的所有相关研究进行系统评价和荟萃分析，研究结果可以为临床提供最高层次和最具可信性的证据。但是，到目前为止，关于PBC与肝癌的相关性尚没有进行循证医学研究。如果能够证实泌尿道感染是PBC的一个病因，而PBC又是发生肝癌的高危因素，那么感染在PBC向肝硬化、肝癌发展过程中的具体作用机制就是一个急需解决的问题。有研究提示，PBC患者肝内胆管上皮细胞（intrahepatic biliary epithelialcells，IBECs）TLR4表达明显上调，可能参与PBC的发病。泌尿道感染主要是革兰阴性细菌，其主要成分为脂多糖（LPS）。因此，我们有理由推测，LPS-TLR4通路在PBC向肝硬化、肝癌发展过程中具有重要作用。为进一步证实以上推测，我们进行了下面的研究：一、通过循证医学手段证实泌尿道感染与PBC的关系；二、通过循证医学手段证实PBC是肝癌的一个高危因素；三、从临床水平探讨TLR4与EMT（该过程是PBC向肝纤维化、硬化发展的一个重要步骤）的相关性及在PBC中的意义；四、探讨LPS-TLR4通路对IBEC发生EMT的诱导作用及其具体机制。第一部分原发性胆汁性肝硬化危险因素的循证医学研究我们主要通过PUBMED、EMBASE、Cochrane图书馆和中国各种医学搜索数据库进行文献检索，按照以下标准纳入相关文献：（1）报告了相对危险度RR和OR，并且提供了95%可信区间的观察性研究；（2）病例对照研究和队列研究；（3）独立的研究，没有重复报告相同人群。应用随机或固定效应模型进行荟萃分析，探讨各种危险因素与PBC的相关性。经过筛查鉴定，我们纳入5篇相关的文献进行系统评价和荟萃分析。5篇文献均为英文文献，包含1913例PBC患者和4697例健康对照。5项研究均涉及吸烟与PBC的相关性，4项研究涉及泌尿道感染与PBC的相关性，3项研究涉及家族史和甲状腺疾病与PBC的相关性，2项研究涉及饮酒、染发、扁桃体切除手术、怀孕年龄、激素治疗、银屑病、类风湿性关节炎和湿疹与PBC的相关性。荟萃分析结果显示，泌尿道感染、吸烟和家族史与PBC的发生密切相关，泌尿道感染患者患PBC的危险度OR=2.02（95%CI：1.4-2.65）；吸烟患PBC的危险度OR=1.67（95%CI：1.41-1.92）；具有PBC家族史人群患PBC的危险度OR=7.56（95%CI：1.9-13.22）。而甲状腺疾病与PBC的发病没有显著相关性OR=3.08（95%CI：0.84-5.32）。为进一步确认研究结果的稳定性，我们对纳入的研究进行了出版偏倚评价。Egger检验和Begger s funnel图分析结果均表明，纳入的研究不存在出版偏倚，提示研究结果还是比较稳定的。这部分研究结果提示，泌尿道感染是PBC的一个重要病因。第二部分原发性胆汁性肝硬化与肝癌相关性的循证医学研究为探讨PBC与肝癌的关系，证实PBC是肝癌的一个重要危险因素，我们在本部分应用系统评价和荟萃分析的方法探讨了PBC与肝癌的相关性。我们主要通过PUBMED、EMBASE和Cochrane图书馆进行文献检索，按照以下标准纳入相关文献：（1）队列研究或病例对照研究；（2）将PBC作为一个暴露因素的研究；（3）将肿瘤作为一个结果的研究；（4）给出RR值及其95%可信区间或能够计算出二者的相关数据的研究；（5）独立的没有重复的研究。如果多个研究报道相同人群或部分相同人群，我们仅纳入最新或数据最全的研究。我们从3510篇文献中筛选、纳入16篇文献，包括17个个体研究，其中有一篇文献报告了两组队列研究，一组是西班牙人群，另一组是意大利人群。我们对17个个体研究进行了系统评价和荟萃分析。这17个个体研究共包含16368名PBC患者。9个研究报告了PBC与所有肿瘤的危险关系；12个研究报告了PBC与肝癌危险的关系，9个研究报告了PBC与乳腺癌危险的关系；5个研究报告了与肾癌危险的关系；5个研究报告了与结肠癌危险的关系。结果显示，与一般人群相比，PBC患者患所有肿瘤的相对危险度RR值为1.55（95%CI：1.28-1.83），即PBC患者患所有肿瘤的危险比一般人群要高55%。PBC患者患肝癌的危险度RR值为18.8（95%CI：10.81-26.79），即PBC患者患肝癌的风险比一般健康人群高17.8倍。通过亚组分析，我们发现在各个亚组PBC均可以显著增高肝癌的患病风险。只有两个亚组例外，分别是美国人群和以人群为基础的研究。虽然在这两个亚组中，PBC患者患肝癌的风险仍然是一般人群的8倍以上（美国人群是23.88倍，以人群为基础的研究是8.61倍），但统计学差异并不显著，这种情况的出现可能主要是因为这两个亚组所包含的研究数量太少（均为3篇），而且异质性很高，缺少统计效能。此外，与其他肿瘤发病危险性的荟萃分析结果显示，PBC与乳腺癌、肾癌等肿瘤的发生无明显相关性，对乳腺癌进行亚组分析的结果显示在各亚组中，PBC均与乳腺癌的发生没有密切关系。这部分研究结果表明，PBC与肝癌的发生密切相关，是肝癌发生的一个高危因素。由于肝纤维化和肝硬化是肝癌的重要原因，而上皮间质转化在纤维化疾病中具有重要作用。结合第一部分的研究，LPS-TLR4通路异常活化是否诱导肝内胆管上皮细胞间质转化？其具体机制如何？我们将在第三、四部分进行探讨。第三部分TLR4及上皮间质转化相关蛋白在原发性胆汁性肝硬化患者的表达及临床意义为进一步探讨TLR4和肝内胆管上皮细胞EMT与PBC向纤维化进展的关系以及二者在PBC进展过程中的关联，我们在本部分研究中应用免疫组化的方法从临床水平检测了TLR4及EMT相关蛋白在PBC患者肝组织门管区胆管上皮细胞的表达。我们收集PBC患者肝穿和肝活检标本共11例，其中病理1期2例，2期3例，3期2例，4期4例，同时收集5例供肝者肝组织切片标本作为正常对照。采用免疫组化的方法检测各组细胞角蛋白CK19、TLR4、E-钙粘蛋白及波形蛋白的表达水平，结果显示CK19在正常人及PBC患者胆管上皮细胞中均有表达，且阳性率随着PBC分期增高而明显降低。TLR4和波形蛋白在正常人肝内胆管上皮细胞几乎无表达，1期PBC患者阳性表达率分别为28.6%和30.0%，2期患者平均阳性率为41.6%和40.1%,3期患者平均阳性率为64%和73.7%,4期患者平均阳性率为73.1%和77.0%。两两比较的结果显示，除1,2期及3,4期外，其余各组间阳性细胞数差异均有统计学意义（P=0.001）。E-钙粘蛋白在正常人肝内胆管上皮细胞表达，而在PBC患者表达明显降低，1期PBC患者E-钙粘蛋白平均阳性率为84%，2期患者平均阳性率为48.1%,3期患者平均阳性率为23%,4期患者平均阳性率为19%。两两比较的结果显示，除正常对照与1期以及3,4期外，其余各组间阳性细胞数差异均有统计学意义（P=0.001）。此外，PBC患者TLR4阳性表达率与E-钙粘蛋白阳性表达率呈负相关（相关系数rs=-0.927，P<0.01）,TLR4与波形蛋白阳性表达率呈正相关（相关系数rs=0.918，P<0.01），波形蛋白与E-钙粘蛋白阳性表达率呈负相关（相关系数rs=-0.918，P<0.01）。因此，PBC患者肝组织门管区肝内胆管上皮细胞TLR4的表达明显增高，而且按照PBC的组织学分期，TLR4随着PBC纤维化严重程度的加深而表达增强。同时，我们发现PBC患者肝组织门管区肝内胆管上皮细胞E-钙粘蛋白表达明显降低、波形蛋白表达明显增高，这种变化也是随着PBC纤维化严重程度的加重而更加明显，提示在PBC向纤维化方向发展的过程中会出现肝内胆管上皮细胞EMT现象，且与TLR4表达密切相关。那么，在PBC的进展过程中，TLR4对肝内胆管上皮细胞EMT是否具有诱导作用及其具体机制，我们将在第四部分通过体外培养肝内胆管上皮细胞进行深入探讨。第四部分TLR4通路对肝内胆管上皮细胞EMT的作用机制为进一步阐明TLR4通路异常活化在PBC进展过程中作用机制，我们拟在本部分研究中体外培养肝内胆管上皮细胞，利用刮痕实验、趋化实验、细胞免疫化学、实时荧光定量PCR、MyD88及Snail小干扰RNA、抑制剂阻断、Western blot、萤光素酶报告等实验方法深入探讨LPS－TLR4信号通路活化对肝内胆管上皮细胞EMT的诱导作用及其具体分子机制。结果显示10ug/ml LPS刺激肝内胆管上皮细胞24小时后，细胞迁移明显高于对照组，经过Transwell小室迁移的细胞数为110.4±9.17，明显高于对照组（75.8±7.78），差异均有统计学意义（P<0.01）。RT-PCR结果显示，10ug/ml,50ug/ml及100ug/ml LPS作用24小时，与对照组比较，E-钙粘蛋白基因表达明显降低，S100A4基因表达明显升高，差异有统计学意义（P<0.01），细胞免疫化学结果显示10ug/ml LPS作用24小时，E－钙粘蛋白表达明显降低，S100A4蛋白表达明显升高。转染MyD88SiRNA后，经10ug/ml LPS刺激24h,刮痕实验显示细胞迁移相对距离明显低于单独LPS刺激组，Transwell小室实验结果显示迁移细胞数为85.6±8.97，明显低于LPS刺激组，且转染MyD88SiRNA组与单独加入LPS组比较，E-钙粘蛋白基因和蛋白表达明显升高，S100A4基因和蛋白表达明显降低，差异有统计学意义（P<0.01）。应用抑制剂PDTC、SB203580及SP600125预刺激后加入10ug/ml LPS刺激24小时，与单独加入LPS组比较，E-钙粘蛋白基因表达明显增高，差异有统计学意义（P<0.01）；抑制剂SB203580预刺激后，S100A4及Snail基因表达比单独加LPS组明显降低，差异有统计学意义（P<0.01），各组Slug基因表达无明显变化。经10ug/ml LPS刺激24小时后，转染Snail SiRNA组E-钙粘蛋白基因表达比未转染组明显增高，S100A4基因表达比未转染组明显降低，差异有统计学意义（P<0.01）。萤光素酶报告实验结果显示10ug/ml LPS刺激转染野生型载体的肝内胆管上皮细胞，相对萤光值比对照组显著升高，差异有统计学意义（P<0.01）,加入AP-1抑制剂100uM6-姜酚后，相对萤光值明显降低，而转染突变型载体组差异无明显变化。通过本部分研究，可以推测LPS通过TLR4-MyD88-P38-AP1-Snail的途径诱导肝内胆管上皮细胞发生EMT，为PBC向纤维化、硬化发展的机理提供了一种可能的解释，为进一步探讨如何逆转PBC向纤维化方向发展提供一种可能的潜在靶点。综上所述，通过以上四部分的研究，我们初步提出PBC发生发展的一个可能机制，即：泌尿道感染-LPS-TLR4通路异常活化-肝内胆管上皮细胞EMT-肝纤维化、硬化-肝癌。这对于有效预防或避免PBC的危险因素，寻找治疗PBC的潜在靶点，实现对PBC的合理预防、有效治疗或病情逆转具有重要的参考价值和借鉴意义。