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增生性瘢痕是整形外科研究的重点之一，增生性瘢痕是创面愈合异常的结果。增生性瘢痕的形成是一个受多种因素调控的过程，其具体机制尚不十分清楚，故目前多种治疗方法效果常不明显。对创面愈合微环境的研究显示血管形成(angiogenesis)过程对于创面愈合有十分重要的意义。新近的研究结果已越来越多的显示血管形成对增生性瘢痕的形成具有十分重要的意义。随着对肿瘤的深入研究，作用较强的血管形成抑制剂得以不断被发现与应用，这也为研究血管形成包括增生性瘢痕在内的防治作用提供了新的尝试机会。 基因治疗和细胞治疗或细胞替代治疗一样，是近年来医学领域乃至生命科学领域研究的热点和前沿。其中一个关键问题是种子细胞或转基因载体细胞的选择，内皮细胞因其具有高度的自我更新能力和分化的潜能，被认为是理想的基因转移的载体细胞。 转基因的方法主要有阳离子脂质体介导法、钙离子沉淀法、电穿孔法、逆转录病毒和腺病毒介导的感染的方法。复制缺陷型腺病毒(Replication-deficent adenoviral vectors，AdVec)因具有高效介导基因的体内、外转移，感染细胞范围广，对靶细胞毒性小以及可 第四军医大学博士学位论文感染静止期和分裂期细胞等特点常被作为介导基因转移的首选载体;以腺病毒作为载体介导基因在内皮细胞的表达已有报道，但复制缺陷型腺病毒感染内皮细胞感染效率有多少?复制缺陷型腺病毒的最佳感染滴度是多少?复制缺陷型腺病毒感染后对内皮细胞的表型有无影响?复制缺陷型腺病毒感染后内皮细胞分化潜能有无改变?复制缺陷型腺病毒感染对内皮细胞的生长增殖的细胞周期有否改变?复制缺陷型腺病毒介导基因转移与常规的脂质体介导的基因转移优势何在?以及是否可以利用复制缺陷型腺病毒高效转墓因效能，通过过表达信号分子或负显性的方法研究内皮细胞分化的信号转导机制?这些都需要探讨。 本研究主要采用人脐静脉内皮细胞(HUVEC)，探讨了HUVEC体外培养和生物学特性，复制缺陷型腺病毒介导的基因在HIJVEC的转移和腺病毒介导的基因对兔耳瘫痕增生影响的实验研究。 全文包括五个部分: 第一部分:人血管生成抑制分子METHI的分子克隆与真核表达。目的克隆人METHI全长cDNA，建立稳定表达人METHI分子的哺乳动物细胞系。方法RT一PCR获取人METH 1 cDNA，序列测定后克隆入真核表达载体pCDNA3.0中，用脂质体转染入HePGZ细胞，G418筛选出稳定表达细胞系，用RT一PCR与W七stem blot分别检测RNA和蛋白表达水平。结果Rl、PCR扩增得到预期大小的目的条带，序列分析表明成熟肤编码区与发表序列【GL5725505]完全一致;克隆入pCDNA3.0中得到MEml真核表达载体，G418筛选3周后得到稳定表达细胞系，RT一PCR与Western blot显示MEml在HepGZ细胞中有高水平表达。结论人METHI全长cDNA成功克隆，并在哺乳动物细胞系HePGZ中获得稳定表达，为进一步研究METHI分子对增生性瘫痕血管形成的作用奠定了理论基础。 第二部分:pcDNA3.0载体介导METHI基因对人脐静脉内皮细魔生长抑树的研究。目的:研究METHI基因对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)体外生长的抑制作用。方法:构建真核表达载体 第四军医大学博士学位论文pCDNA3.o一METHI，转染肝癌细胞系HepGZ中。体外扩增HUVEC，采用MTT法检测HepGZ/METHI及HepGZ培养的上清对HIJVEC增殖的影响和流式细胞仪检测内皮细胞凋亡率。结果:成功的构建真核表达载体pCDNA3.O一METHI，并在HePGZ中稳定表达。MTT法结果显示:与对照组相比，HePGZ胭ETHI组对HtJVEC增殖有明显的抑制作用，并呈剂量依赖性(P<0.01);而HePGZ组对HUVEC增殖有明显的促进作用，呈剂量依赖性(P<0.01)。HePGZ/METHI组凋亡率增加。结论:解DNA3 .0-METHI对HUVEc体外生长具有明显的抑制作用，提示METHI对瘫痕内血管的抑制治疗具有潜在的临床应用价值。 第三部分:同源重组EGFP和METHI腺病毒载体的制备。目的为开展瘫痕的基因治疗，利用大肠杆菌同源重组构建重组腺病毒载体并在293细胞制备高滴度的病毒。方法自真核表达载体pMD18一T一METHI中酶切出METHI基因，亚克隆至带有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)表达盒的腺病毒穿梭质粒pAdTrack一cMV中，形成转移质粒pAdTrack一CMV一METHI，在大肠杆菌BJS 183内与腺病毒骨架质粒pAdEasy一1同源重组，得到重组腺病毒载体pAd一METHI。以pAd一METHI为模板，经DNA测序正确后，用Pacl酶切线性化pAd一 METHI，转染293细胞，包装成重组病毒颗粒，荧光显微镜观察转染细胞EGFP的表达，采用PCR方法对重组腺病毒进行鉴定。结果制备了METHI重组腺病毒载体，METHI重组腺病毒可感染293细胞并在293细胞中进行有效的复制。结论应用细菌内同源重组能够快速构建腺病毒载体，制备高滴度重组病毒，为METHI基因功能研究莫定了基础。 第四部分:腺病毒介导的METHI基因在HUVEC中的高效表达。目的评估重组腺病毒对HUVEC的感染效率和对HIJVEC的抑制作用。方法含有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和METHI 基因的复制缺陷型腺病毒，以不同滴度体外感染HUV