研究背景:抑郁症作为最常见的神经精神类疾病之一,是全世界普遍面临的严峻医学问题和社会问题,其典型症状主要包括快感缺失、行为绝望、心境低落和悲观厌世等,严重影响和降低人们的生存质量。抑郁症的发病机制复杂,且目前临床抗抑郁治疗预后差、新开发药物在临床试验中失败率高,因此亟需寻找抑郁症治疗的新靶点。多病因机制是抑郁症发病的显著特点,近年临床证据表明,神经炎症是抑郁症发病的潜在危险因素,但机制不清。有研究表明小胶质细胞是中枢神经系统炎症反应的主要参与者,本课题组前期的系列性研究发现抑郁症相关脑区,如海马、前额叶皮质等部位小胶质细胞激活,并伴随海马齿状回区（Dentate gyrus,DG）新生的神经元减少。成年神经发生被认为是脑稳态维持和疾病发生的重要参与者,主要受遗传背景、环境应激、生长因子、病理性损伤等因素的调节,但其是否参与抑郁症的发生发展,特别是小胶质细胞与神经干细胞（或神经元）之间的双向交互作用是否参与了神经发生的调控过程,目前尚不清楚。基于此,本研究拟构建慢性不可预知性温和应激刺激（Chronic unpredicted mild stress,CUMS）诱导的大鼠抑郁模型,采用行为学、细胞和分子生物学、病毒和遗传学等多种实验方法和技术,探究小胶质细胞外泌体是否能够调控抑郁症大鼠海马神经发生,并探讨了其在抑郁症发病过程中的作用和机制。研究方法:（1）实验大鼠被随机分为Control组（空白对照）和CUMS组,给予CUMS组大鼠五周慢性不可预知性应激刺激后,进行相关的行为学测试,如蔗糖偏好实验、强迫游泳实验、高架十字迷宫实验和旷场实验等评估大鼠抑郁样及焦虑样行为;采用免疫荧光实验检测大鼠海马DG区Nestin 阳性细胞、Sox-2阳性细胞和DCX 阳性细胞等神经新生相关细胞的数量变化以及小胶质细胞的激活状态。（2）收集、纯化各组大鼠血清中的外泌体,运用Western bolt、流式细胞术等技术检测CD63、CD81、MCT-1、CD14、IL-1β、CD13等外泌体或小胶质细胞特异性蛋白标志物的表达。收集LPS刺激后BV2小胶质细胞分泌的外泌体,然后与神经干细胞共培养,免疫荧光技术观察Ki67阳性神经干细胞、BrdU 阳性神经干细胞的数量变化;利用免疫荧光技术观察DCX 阳性细胞、βⅢ-Tubulin 阳性细胞、MAP2阳性细胞和NeuN阳性细胞的数量变化。（3）收集大鼠血清外泌体进行miRNA测序,利用生物信息学技术寻找与调控神经新生相关的差异表达miRNA。（4）构建敲减miR-146a-5p的慢病毒,转染BV2小胶质细胞,并收集分泌的外泌体,与神经干细胞共培养。利用免疫荧光技术观察BrdU 阳性细胞等增殖相关细胞数量的变化;利用免疫荧光技术观察DCX 阳性细胞和βⅢ-Tubulin 阳性细胞数量的变化。（5）构建过表达或敲减miR-146a-5p的AAV腺相关病毒,分别立体定位注射于不同组别的大鼠双侧海马DG区。病毒感染三周后,对其进行蔗糖偏好实验和强迫游泳实验等行为学测试;采用免疫荧光方法检测大鼠海马DG区神经新生相关指标的变化;运用Western blot技术检测Krüppel样转录因子4（KLF4）及其下游相关蛋白CDKL5、p-STAT3的表达。（6）构建敲减KLF4的AAV腺相关病毒,立体定位注射于正常大鼠双侧海马DG区。病毒感染三周后,对其进行蔗糖偏好实验和强迫游泳实验等行为学测试;采用免疫荧光方法检测大鼠海马DG区神经新生相关指标的变化;运用Western blot技术检测其下游相关蛋白CDKL5、p-STAT3的表达。（7）构建敲减或过表达环状RNA circANKS1B的AAV腺相关病毒,立体定位注射于不同组别大鼠海马DG区。病毒感染三周后,对其进行蔗糖偏好实验和强迫游泳实验等行为学测试;采用免疫荧光方法检测神经新生相关指标的变化;运用Western blot、RT-PCR等技术检测miR-146a-5p及其下游相关蛋白KLF4、CDKL5、p-STAT3的表达。研究结果:（1）与正常对照组相比,CUMS组大鼠在蔗糖偏好实验中蔗糖消耗的百分比显著降低,强迫游泳实验中静止不动的时间显著延长,在旷场实验中穿格次数无显著性差别,在高架十字迷宫实验中开放臂的停留时间比和进入次数比均显著减少。与空白对照组相比,CUMS组大鼠海马DG区Nestin 阳性细胞、Sox-2阳性细胞和DCX阳性细胞的数量显著减少,小胶质细胞显著增多并呈阿米巴样活化状态。提示慢性不可预知性温和应激刺激诱导大鼠呈现抑郁样行为、激活小胶质细胞并抑制海马神经新生。（2）Western blot和流式细胞术的结果显示,与空白对照组相比,CUMS组大鼠血清外泌体CD63和CD81的表达水平明显增多,且小胶质细胞特异性的蛋白TMEM119、CD13、MCT-1、CD14、CD11b和IL-1β的表达也显著增多,提示抑郁样大鼠外周血中增多的外泌体主要来源于小胶质细胞。免疫荧光结果显示,LPS处理后的小胶质细胞源性的外泌体与神经干细胞共培养,可显著减少Ki67阳性细胞、BrdU 阳性细胞、DCX阳性细胞、βⅢ-Tubulin阳性细胞、MAP2阳性细胞和NeuN阳性细胞数量,提示小胶质细胞来源的外泌体可抑制神经干细胞的增殖和分化。（3）测序结果显示,抑郁样大鼠血清外泌体中存在多种miRNA差异性表达。其中,小胶质细胞特异性的miR-146a-5p在抑郁样大鼠血清外泌体中显著上调并与调节干细胞多能性的信号通路密切相关,提示外泌体富含的miR-146a-5p可能是调控神经新生的关键分子。（4）免疫荧光结果显示,敲减BV2小胶质细胞中的miR-146a-5p后,其分泌的外泌体对BrdU阳性细胞、DCX 阳性细胞、βⅢ-Tubulin 阳性细胞数量无显著性影响,提示小胶质细胞外泌体通过其富含的miR-146a-5p调控神经干细胞增殖和分化。（5）正常大鼠海马DG区过表达miR-146a-5p可诱导产生抑郁样行为,海马DG区神经干细胞和新生神经元数量减少,并伴随KLF4和CDKL5表达减少,p-STAT3表达增加。抑郁样大鼠海马DG区敲减miR-146a-5p可改善大鼠抑郁样行为,神经干细胞和新生神经元数量减少,并伴随KLF4和CDKL5表达增多,p-STAT3表达减少。（6）正常大鼠海马DG区敲减KLF4可诱导大鼠产生抑郁样行为,新生神经元数目减少,并伴随CDKL5表达减少,p-STAT3表达增多。（7）正常大鼠海马DG区敲减环状RNA circANKS1B可诱导大鼠产生抑郁样行为,新生神经元减少,并伴随miR-146a-5p表达增多,KLF4和CDKL5表达减少,p-STAT3表达增多。抑郁样大鼠海马DG区过表达circANKS1B可改善大鼠抑郁样行为,新生神经元增多,并伴随miR-146a-5p表达减少,KLF4和CDKL5表达增多,p-STAT3表达减少。结论:（1）慢性不可预知性温和应激刺激可诱导大鼠产生抑郁样行为,并激活小胶质细胞、抑制大鼠海马DG区神经发生。（2）抑郁样大鼠血清中含有大量来源于小胶质细胞的外泌体,可显著抑制神经干细胞的增殖、分化。（3）小胶质细胞来源的外泌体通过其携带的miR-146a-5p抑制神经干细胞的增殖以及向成熟神经元的分化,导致新生的神经元数目减少。（4）MiR-146a-5p直接靶向KLF4,并通过抑制KLF4/CDKL5途径调控大鼠海马DG区神经发生。（5）CircANKS1B通过抑制miR-146a-5p/KLF4的信号通路参与调控海马神经发生及抑郁症的发病过程。