论文部分内容阅读
目的和背景:脓毒症(sepsis)所致急性呼吸窘迫综合征(acute respirarory distress syndrome,ARDS)为临床常见危重症,肺泡上皮细胞损伤是其主要病理改变之一。白细胞介素17(interleukin-17,IL-17)是Th17细胞分泌的主要致炎因子,可通过与相应受体(IL-17R)结合,激活靶细胞产生各种炎症细胞因子,介导炎症细胞到达局部引起组织损伤。目前有关IL-17在急性肺损伤(acute lung injury,ALI)中的作用研究相对较少。本研究选取人肺泡Ⅱ型上皮细胞(alveolar epithelial cell typeⅡ,ATⅡ)系A549细胞、小鼠为研究对象,以脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)为刺激因素,探究IL-17对A549细胞和ALI小鼠炎症反应的影响及相关机制,并分析ARDS患者IL-17的表达水平和意义,为临床治疗和评估sepsis-ARDS提供更多理论依据。内容和方法:第一部分:LPS对人肺泡Ⅱ型上皮细胞表达IL-17RC的影响1.以体外培养的A549细胞为研究对象,首先用琼脂糖凝胶电泳、Western blot法分别检测A549细胞IL-17RC的核酸和蛋白表达水平。2.以0.01、0.1、1、10μg/ml不同浓度的LPS刺激A549细胞3 h;以0.1μg/ml的LPS刺激A549细胞1、3、6、12 h,用RT-PCR检测IL-17RC mRNA水平。3.以0.1μg/ml的LPS刺激A549细胞1、3、6、12、24 h,用流式细胞仪(FCM)和Western blot法检测IL-17RC的蛋白水平。第二部分:IL-17对人肺泡Ⅱ型上皮细胞功能的影响及其机制1.以体外培养的A549细胞为研究对象,用0.1、0.5、1μg/ml不同浓度的IL-17刺激A549细胞3 h;再以0.5μg/ml的IL-17分别刺激A549细胞1、3、6、12、24 h。在1、3、6 h提取A549细胞RNA,在6、12、24 h收集细胞培养上清液和A549细胞蛋白。2.空白、LPS(0.1μg/ml)、IL-17(0.5μg/ml)、LPS(0.1μg/ml)+IL-17(0.5μg/ml)。在6、24 h收集细胞培养上清液,在24 h收集A549细胞蛋白。3.空白、IL-17(0.1μg/ml)、IL-17(0.2μg/ml)、IL-17(0.5μg/ml)、IL-17(0.5μg/ml)+anti-IL-17RC Ab(0.1μg/ml)。在6、24 h收集细胞培养上清液,在24 h收集A549细胞蛋白。4.空白、AG490(50μmol/L)、IL-17(0.5μg/ml)、IL-17(0.5μg/ml)+AG490(50μmol/L)。在6、24 h收集细胞培养上清液,在24 h收集A549细胞蛋白。5.用RT-PCR检测SPA、ENaC-α、TNF-α、IL-8 mRNA水平,ELISA法检测上清液SPA、TNF-α、IL-8蛋白水平,Western blot检测细胞ENaC-α、p-STAT3、p-Akt水平。第三部分:IL-17在LPS诱导的小鼠ALI中的作用及机制研究1.以气道滴注LPS(3 mg/kg)建立的ALI小鼠模型为研究对象。对照组、ALI建立后6、12、24 h。ELISA法检测肺组织、BALF和血浆的IL-17水平。2.对照组(PBS)、Ab对照组(1μg)、LPS组(3 mg/kg LPS)、LPS+IL-17Ab组(3 mg/kg LPS+6 h后静脉注射1μg IL-17Ab)。3.HE染色评估肺病理损伤,测量肺湿/干比,BCA法测定小鼠BALF总蛋白浓度,BALF总细胞计数,ELISA法检测BALF和血浆中TNF-α、IL-10水平。免疫组化分析肺组织RORγt表达,Western blot检测肺组织RORγt和p-Akt表达。第四部分:IL-17对ARDS患者病情的评估价值1.以sepsis-ARDS患者为研究对象,18例健康对照组、35例sepsis-ARDS患者,ELISA法检测患者血浆的IL-17水平。2.分析sepsis-ARDS患者IL-17水平与氧合指数(PaO2/FiO2)和预后的关系。结果:第一部分:LPS对人肺泡Ⅱ型上皮细胞表达IL-17RC的影响1.A549细胞在核酸和蛋白水平表达IL-17RC。2.0.1μg/ml LPS刺激后IL-17RC mRNA表达升高最为显著,刺激3 h后IL-17RC mRNA表达最高,6 h即开始下降。3.0.1μg/ml LPS刺激后IL-17RC蛋白水平6 h开始升高,24 h呈高表达水平。第二部分:IL-17对人肺泡Ⅱ型上皮细胞功能的影响及其机制1.A549细胞SPA、ENaC-αmRNA表达较高,IL-17干预后明显下降,以0.5μg/ml浓度刺激3 h时下降最为明显。A549细胞TNF-αmRNA检测不到、IL-8 mRNA表达水平较低,IL-17干预后均明显升高,以0.5μg/ml浓度刺激3 h时升高最为明显。2.A549细胞在受IL-17刺激后,SPA水平在6 h就明显下降,ENaC-α在24 h时降至最低,TNF-α、IL-8水平呈上升趋势,至24 h呈高表达水平。3.A549细胞在接受LPS、IL-17共同刺激6 h后,SPA水平均明显下降,LPS+IL-17组较LPS和IL-17单独刺激时下降更为显著。A549细胞在接受LPS、IL-17共同刺激24 h后ENaC-α表达降低,TNF-α、IL-8水平均升高,LPS+IL-17组较LPS和IL-17单独刺激时变化更为显著。4.A549细胞在接受IL-17刺激6 h后SPA水平降低,24 h后ENaC-α水平降低、TNF-α和IL-8水平升高,变化程度与IL-17浓度存在相关性,并且在加入anti-IL-17RC Ab后变化幅度均有明显缓解。5.A549细胞在接受IL-17刺激24 h后p-STAT3、p-AKT水平升高,有浓度依赖性,可以被anti-IL-17RC Ab部分阻断。STAT3抑制剂AG490能缓解IL-17对A549的损伤作用。第三部分:IL-17在LPS诱导的小鼠ALI中的作用及机制研究1.小鼠ALI模型建立后肺组织、BALF和血清中IL-17水平较对照组明显升高,12h升高最显著。2.IL-17Ab干预能明显降低肺损伤评分和湿/干比、减少BALF的总细胞数和蛋白水平。IL-17Ab干预能降低BALF和血浆中的TNF-α水平,提高IL-10水平。3.免疫组化分析了Th17细胞相关转录因子RORγt,显示IL-17Ab干预能减少肺组织RORγt表达。Western blot检测显示IL-17Ab干预能减少ALI肺组织RORγt和p-Akt表达。第四部分:IL-17对ARDS患者病情的评估价值1.相对于18例健康对照组而言,35例sepsis-ARDS患者血浆的IL-17水平明显升高。2.IL-17和PaO2/FiO2是一个负性关系。相对于存活组而言,死亡组IL-17水平升高更显著。结论:1.IL-17RC分布于A549细胞,在LPS刺激下存在一定的时效和量效关系,以0.1μg/ml刺激后表达最高,并且在3 h IL-17RC mRNA表达最高,24 h蛋白水平表达明显增高。2.IL-17通过JAK/STAT3、PI3K/Akt信号通路导致A549细胞损伤,表现为SPA、ENaC-α表达下降,TNF-α、IL-8分泌增高,并且与LPS有协同作用,可被anti-IL-17RC Ab、AG490部分缓解。3.LPS建立的ALI小鼠肺组织、BALF和血浆的IL-17水平明显升高,IL-17Ab干预能通过影响RORγt和PI3K/Akt的表达减少肺部炎症细胞浸润、降低肺泡通透性,促进炎症反应由Th17向Treg偏移,从而缓解ALI症状。4.sepsis-ARDS患者血浆IL-17水平明显增高,并且和PaO2/FiO2及存活率存在着负相关,IL-17或许能成为评估ARDS严重程度及判断预后的指标。