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目的:PD-L1作为PD-1/PD-L1免疫抑制通路的重要组成成分,在最近新兴的免疫抑制通路检查点相关抗体药物的临床应用中起着重要作用,宫颈癌作为这些抗体药物潜在的临床应用者,研究其肿瘤细胞表面的PD-L1表达情况及相关调控因素具有重要的临床意义,可以为PD-1/PD-L1抗体药物在宫颈癌临床治疗中提供相应的检测靶点,并为导致宫颈癌的HPV感染的预后判断提供帮助。方法:1)收集66例宫颈癌患者病理标本,免疫组化检测肿瘤细胞表面PD-L1和肿瘤浸润淋巴细胞表面PD-1/PD-L1的表达情况,同时检测肿瘤细胞MLH1和MSH2蛋白的表达情况,荧光标记扩增产物长度多态分析方法检测肿瘤细胞的微卫星不稳定状态,利用免疫组化和MSI的检测结果共同定义宫颈癌患者的dMMR状态和pMMR状态,进而比较两种状态下,肿瘤细胞表面PD-L1和肿瘤浸润淋巴细胞表面PD-1/PD-L1的表达差异。最后通过RNA干扰技术抑制HeLa细胞的MLH1蛋白的表达,模拟形成稳定的dMMR细胞株,通过RT-PCR和Western blot技术分别检测MLH1抑制前后HeLa细胞PD-L1的mRNA和蛋白质表达情况;2)收集20例HPV感染的宫颈癌患者的冷冻标本,首先利用Agilent Sureselect富集液相芯片结合Illumina二代测序技术对HPV宿主细胞基因组的整合情况进行检测,重点关注HPV在宿主细胞的9p24.1区域和CD274的3’-UTR的整合情况。然后合成HPV整合CD274基因3’-UTR的重组质粒载体转染HeLa细胞,并另外合成micRNA-384的人工模拟物和重组载体一起转染HeLa细胞后,分别利用qRT-PCR和Western blot技术检测HeLa细胞和两种转染方式后PD-L1的mRNA和蛋白质的表达情况;3)收集54例初次诊断的HPV16感染伴有宫颈病变的患者,20例健康人和20例HPV16不伴有宫颈病变患者的宫颈脱落细胞标本,流式细胞术检测脱落细胞表面的PD-L1表达情况,分别计算PD-L1阳性细胞比例和阳性细胞平均荧光道数值,比较两个指标在三组人群中的差异。通过MS-HRM技术检测54例HPV16感染伴有宫颈病变患者的HPV16-L1基因的甲基化情况,流式细胞术对病变细胞进行DNA倍体分析。把54例标本分为L1基因高甲基化组和低甲基化组,DNA异倍体阳性和阴性组,HPV单一感染组和多重感染组,分别比较PD-L1阳性细胞比例和阳性细胞平均荧光道数值在不同甲基化组,不同DNA倍体情况下,不同感染状态下的差别。最后对54例HPV16感染伴有宫颈病变的患者每隔三个月进行为期18个月的随访研究,判断宫颈脱落细胞表面PD-L1表达水平,L1基因甲基化水平及HPV亚型感染状态对HPV清除时间的影响,并通过多元Cox风险评估模型判断PD-L1表达水平,L1基因甲基化水平及HPV亚型感染状态对HPV清除预后的影响。结果:1)66例宫颈癌患者中肿瘤细胞表达PD-L1阳性率为59.1%,其dMMR状态的检出率是25.8%。肿瘤浸润淋巴细胞表达PD-L1和PD-1的检出率分别是47.0%和60.6%。dMMR和pMMR状态宫颈癌患者肿瘤细胞PD-L1的表达情况存在明显差异(P<0.05),在dMMR患者中,肿瘤细胞表面PD-L1表达情况和肿瘤浸润淋巴细胞表面PD-1的表达程度不具有相关性(r_s=0.161,P=0.537),而在pMMR患者中两者具有较好的相关性(r_s=0.645,P<0.05)。RNA干扰技术可以使HeLa细胞株的MLH1蛋白表达程度降低到正常水平的2%,可以认为模拟形成了稳定的dMMR状态的细胞株,dMMR状态的细胞株相比于正常HeLa细胞株,其PD-L1的mRNA水平升高了1.50倍,而PD-L1蛋白的表达则升高了1.27倍;2)20例宫颈癌患者均存在HPV宿主细胞基因组整合现象,其中有8例存在9号染色体9p24.1区域的整合现象,涉及该区域10个基因,其中包括PD-L1基因,此8例标本肿瘤细胞均存在PD-L1的高表达。而对于HPV整合到CD274的标本,其整合位点位于CD274基因的3’-UTR区域,且该整合位点同时是micRNA-384结合CD274基因的位点。通过人工合成整合后的CD274基因3’-UTR基因片段导入HeLa细胞株,发现PD-L1的mRNA和蛋白质表达水平相比于正常HeLa细胞株分别提高了23.68倍和5.65倍。而同时导入micRNA-384人工模拟物和整合后的CD274基因3’-UTR基因片段后,PD-L1的mRNA和蛋白质表达水平相比于正常HeLa细胞株分别提高了14.29倍和3.42倍;3)HPV感染伴有宫颈病变患者的脱落细胞表面的PD-L1阳性细胞比例和阳性细胞平均荧光道数均明显高于正常健康人和HPV感染不伴有宫颈病变者;而在HPV感染伴有宫颈病变患者中,L1基因高甲基化组,DNA异倍体阳性组和HPV多重感染组的PD-L1阳性细胞平均荧光道数明显高于L1基因低甲基化组,DNA异倍体阴性组和HPV单一感染组。生存曲线比较发现高PD-L1表达水平,高L1基因甲基化水平和HPV多重感染均可以延长HPV的清除时间,而多元Cox风险评估模型证明相比于PD-L1低表达患者,宫颈细胞高表达PD-L1者有2.043倍的可能存在HPV不被清除;同样相比于HPV-L1基因低甲基化,L1基因高水平甲基化患者HPV不被清除的可能性是2.797倍;而对于HPV多重感染患者,其HPV感染不被清除的风险是HPV单一感染患者的3.050倍。结论:PD-L1在宫颈癌细胞表面普遍表达,dMMR状态可以增强宫颈癌细胞表面PD-L1的表达;HPV宿主细胞基因组整合到特定区域可以提高PD-L1的表达,特定情况下还可以通过抑制micRNA的生理功能导致PD-L1的高表达;宫颈脱落细胞PD-L1的高表达可以增加HPV感染的治疗难度。