非编码RNA AsrC对伤寒沙门菌在巨噬细胞中生存能力的影响及作用机制研究

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目的:  近年来,通过计算机预测、寡核苷酸芯片和高通量测序技术,细菌中已经发现许多非编码RNA(ncRNA),可以参与细菌的基因表达调控。通过RNA测序我们发现了伤寒沙门菌(S.Typhi)中由rseC对侧的反义链编码的ncRNA AsrC,并对其分子特性和功能做了初步研究。本文旨在探讨伤寒沙门菌中ncRNA AsrC的作用机制。  方法:  1.巨噬细胞胞内生存实验。比较AsrC高表达菌株(WT+pBAD-asrC)和空质粒对照株(WT+pBAD)作用THP-1巨噬细胞0,12,24 h后的增殖和复制能力。  2.AsrC对靶基因rseC的影响。通过Northern blot和qRT-PCR检测WT+pBAD-asrC和WT+pBAD中rseC mRNA的水平。通过自杀质粒法构建染色体rseC3×Flag融合菌株,将AsrC高表达质粒和空质粒电转至融合菌株中,用抗Flag抗体通过Western blot检测两者RseC蛋白的表达水平。  3.AsrC对σE(RpoE)的影响及机制分析。通过Northern blot和qRT-PCR检测WT+pBAD-asrC和WT+pBAD中rpoE mRNA的水平,Westernblot检测两者RpoE蛋白水平。将高表达质粒和空质粒导入rseC缺陷株中,构建ΔrseC+pBAD-asrC和ΔrseC+pBAD菌株,通过qRT-PCR和Western blot检测两者rpoE mRNA和RpoE蛋白的水平。  4.AsrC在巨噬细胞内作用机制分析。通过qRT-PCR检测巨噬细胞内 WT+pBAD-asrC和WT+pBAD中asrC、rseC和rpoE的表达水平。Western blot检测WT+pBAD-asrC和WT+pBAD中自噬标志蛋白LC3的水平。  结果:  1.巨噬细胞胞内生存实验结果显示, WT+pBAD-asrC菌株胞内生存能力低于WT+pBAD菌株。  2.Northern blot和qRT-PCR检测靶基因的mRNA水平,结果显示与WT+pBAD相比,WT+pBAD-asrC中rseC mRNA表达上调。利用自杀质粒法成功构建成功构建染色体rseC3×Flag融合菌株,Westernblot检测RseC蛋白,结果显示与WT+pBAD相比,WT+pBAD-asrC中RseC蛋白水平明显增加。  3.Northern blot、qRT-PCR和Western blot检测rpoE表达的影响,结果显示,与WT+pBAD相比,WT+pBAD-asrC中rpoE mRNA以及RpoE蛋白表达增加,在ΔrseC+pBAD-asrC和ΔrseC+pBAD菌株中rpoEmRNA以及RpoE蛋白无明显差异。  4.感染巨噬细胞后,qRT-PCR结果显示,高表达AsrC同样可以增加对侧靶基因rseC mRNA水平,但rpoE无明显变化。Western blot检测自噬标志蛋白LC3结果显示,WT+pBAD-asrC和WT+pBAD LC3的水平无明显差别。  结论:  1.高表达AsrC可以降低伤寒沙门菌(S.Typhi)在巨噬细胞中的存活能力。  2.高表达AsrC能增加靶基因rseC mRNA和蛋白水平,同时也能增加rpoE mRNA和蛋白的水平,AsrC通过rseC影响rpoE的表达。  3.在巨噬细胞内,高表达AsrC能提高靶基因的水平,但与σE不相关。  4.AsrC影响S.Typhi在巨噬细胞内的存活可能与自噬无直接相关。
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