1.研究背景和目的鼠形动物指外形像鼠的一大类病媒生物,主要包括啮齿目的鼠科动物和真盲缺目的鼩鼱科动物。家栖鼠形动物栖息在城镇或乡村居民环境中,与人类接触机会多,是多种人类传染病的传染源。掌握家栖鼠形动物携带病原体的本底资料,对于鼠源性疾病的防控具有非常重要公共卫生学意义。目前鼠源性病原体调查一般是针对特定某种或几种病原体进行,难以认识鼠形动物携带病原的整体情况。近年来,高通量测序方法的出现为检测人和动物体内外环境中细菌和病毒群落构成提供了有效手段。本研究采用16SrDNA高通量测序和宏病毒组学的方法,探究我国部分地区家栖鼠形动物携带的细菌和病毒的群落构成、特征和差异等。同时,基于宏病毒组学研究结果,对鼠形动物样本中的丰度较高的几种重要病毒进行分子流行病学分析。2.研究方法2.1动物捕获和标本采集采用笼捕法,2014年8月至2017年6月在广东省的广州市、深圳市和茂名市、福建省的厦门市、湖南省的益阳市和云南省的麻栗坡县捕获鼠形动物。其中2015年5月至2016年4月期间,在广州市白云区南方医科大学社区(包括南方医院、居民区和教学区)进行了为期一年的监测和样本采集,每间隔一个月连续采集一次。采集血清、咽拭子和直肠端粪便样本,-80℃储存待检。2.216S rDNA高通量测序样本文库制备、测序和生物信息学分析选取广州市白云区2015年5月至2016年4月期间的鼠形动物监测样本为研究对象,每月随机选取褐家鼠和臭鼩鼱各一份粪便标本,共计24个样本。使用细菌16S通用引物对粪便样本中细菌V4区域进行扩增后,构建文库,使用Illumina HiSeq进行高通量测序,并进一步进行物种注释。2.3宏病毒组检测样本文库制备、测序和生物信息学分析选取广州市白云区2015年5月至2016年4月期间的鼠形动物监测样本为研究对象。按照动物种属、季节和样本类型对所有样本进行合样。动物种属分为褐家鼠、黄胸鼠和臭鼩鼱三类,季节分为夏秋季和冬春季,样本类型分为咽拭子、粪便和血清三类,合计1 8份宏病毒测序样本。使用Illumina HiSeq进行高通量测序,对测序获得的原始数据进行质量控制和宿主序列过滤后,与NCBI的MicroNR、MicroNT数据库进行BLAST 比对,获得序列的物种注释结果。2.4家栖鼠和臭鼩鼱几种病毒分子流行病学调查根据宏病毒组的初步注释结果,选择几种丰度相对较高的病毒,进一步进行分子流行病学分析。用 Takara 公司 MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit 试剂盒提取动物咽拭子、粪便和血清标本病毒核酸。根据参考序列,使用Primer Primer5软件设计针对不同病毒的特异性引物以及基因组扩增引物,进行PCR扩增,阳性样本送华大基因(广州)进行测序。使用SeqMan软件进行序列拼接,获得近全长的病毒基因组序列。使用MEGA6中的ClustalW进行多序列比对,基于比对结果,使用邻接法(neighbor-joining,NJ)和最大似然法(maximum likelihood,ML)构建系统进化树,并使用Bootstrap值(1000次自检)对系统进化树的稳健性进行检验。3.结果3.1鼠形动物捕获结果本研究共捕获1072只鼠形动物,其中包括褐家鼠643只(60.0%),黄胸鼠68只(6.3%),黄毛鼠48只(4.5%)和臭鼩鼱313只(29.2%)。3.216S rDNA高通量测序结果3.2.1测序和物种注释结果概况通过测序,24个粪便样本平均获得了约8.6万条原始测序数据(Raw Reads),平均包含576个操作分类单元(OTUs)。24个样本共注释到203个科、420个属和197个种的细菌。所注释到的420个细菌属丰度最高的前5位为:梭菌属、乳杆菌属、肠球菌属、埃希氏菌属和普氏菌属。此外,还注释到葡萄球菌属、链球菌属、假单胞菌属、变形杆菌属、弧菌属、奈瑟氏菌属、芽孢杆菌属和棒状杆菌属等大量致病和条件致病菌。3.2.2不同种属(褐家鼠和臭鼩鼱)以及不同季节样本肠道菌群结构比较褐家鼠和臭鼩鼱肠道菌群结构具有独特特征,优势菌种和特有菌种均存在差异。褐家鼠注释到89个目、157个科和167种细菌,臭鼩鼱注释到110个目、196个科和189种细菌。在属水平上,褐家鼠粪便标本中普拉梭菌属、厌氧弧菌属、毛螺旋菌属、罕见小球菌属、拟普雷沃菌属、厌氧螺菌属、巨单胞菌属、光岗菌属和劳森菌属等丰度较高。而在臭鼩鼱粪便标本中,立克次氏小体属、李斯特菌属、寡养单胞菌属、艰难梭菌属、支原体属、红假单胞菌、和醋酸杆菌属等丰度较高。不同季节褐家鼠和臭鼩鼱肠道菌种数和优势细菌也存在差异。褐家鼠四个季节的4组样本携带506个共同的菌种(OTUs),同时分别携带74种、84种、72种和52种特有的OTUs。臭鼩鼱四个季节的4组样本,共同携带342个共同的OTUs,同时分别携带111种、29种、165种和315种特有的OTUs。3.3宏病毒组学结果3.3.1测序和物种注释结果概况18份宏病毒测序样本共获得了 92.3G的测序数据,注释到213个病毒属,包含动物病毒、昆虫病毒、植物病毒以及藻类病毒等。丰度最高的前5个病毒属分别是:博卡病毒属、依赖病毒属、细小病毒科未分类病毒属、未分类病毒属和细小病毒科的Ambidensovirus。注释结果中丰度较高的哺乳动物病毒主要有巨细胞病毒属、人类乳头瘤病毒属、丙型肝炎病毒属、瘟病毒属、札幌病毒属、正痘病毒属、圆环病毒属、动脉炎病毒属、正肝病毒属、单纯疱疹病毒属、轮状病毒属和慢病毒属等。3.3.2鼠形动物不同种属、不同季节及不同样本类型的病毒群落特征褐家鼠、黄胸鼠和臭鼩鼱的病毒群落具有一定的差异,共同携带97个相同属的病毒,同时分别携带22个、13个和33个特有的病毒属。不同季节采集的褐家鼠和黄胸鼠样本毒群落构成存在较大的差异,夏秋季样本携带较多的依赖病毒属病毒和未分类病毒,而冬春季样本则携带较多的博卡病毒属病毒。不同季节臭鼩鼱样本病毒群落构较为相近。粪便样本病毒的绝对丰度远高于咽拭子和血清,并包含大量的特有的病毒属,其中哺乳动物病毒主要包括:札幌病毒属、圆环病毒属和嵴病毒属等。3.4四种病毒的分子流行病学特征3.4.1细环病毒鼠形动物咽拭子、粪便和血清中的鼠细环病毒(RoTTV)核酸总阳性率分别为:22.8%(113/496)、29.1%(142/488)和 23.8%(54/227)。4个省份所采集的标本以及咽拭子、粪便和血清标本中均有RoTTV检出。在臭鼩鼱的咽拭子和血清中分别检出一份RoTTV阳性。获得了 12条来自褐家鼠咽拭子的RoTTV近全长的序列,长度在2245bp和2399bp之间。系统进化树结果显示,12条RoTTV序列与已发表的RoTTV1、RoTTV2以及其它动物源的细环病毒差异较大,聚为独立的进化枝。进一步的核酸和氨基酸相似度等分析,均提示本研究中所获得的细环病毒(RoTTV3)为一个新的病毒基因型。3.4.2猪博卡病毒鼠形动物粪便样本中猪博卡病毒(PBoV)核酸阳性率为60.5%(309/511),高于血清(22.9%,52/227)和咽拭子(7.5%,39/519)。其中褐家鼠和黄胸鼠的整体阳性率高于黄毛鼠和臭鼩鼱。4个省份所采集标本中均有检出PBoV,提示PBoV在我国鼠形动物中具有广泛的分布。在褐家鼠咽拭子样本中,获得了 5条近全长的PBoV基因组序列,长度在4715bp和4798 bp之间。系统进化树结果显示,本研究中获得的5条PBoV序列同PBoV G1-3以及其它动物源的博卡病毒序列差异较大,聚为独立的进化枝,提示本研究中所获得的猪博卡病毒(PBoV G4)为一个新的病毒基因群。3.4.3鼠博卡病毒鼠博卡病毒(RBoV)在咽拭子和粪便的总阳性率为23.7%(123/519)和60.0%(286/511),但在血清中未检出。RBoV在褐家鼠和黄胸鼠的咽拭子(29.2%,19/408 和 10.0%,4/40)和粪便(65.7%,266/405 和 51.3%,20/39)中均有检出,但在黄毛鼠和臭鼩鼱中却均未检出该病毒。在四个省份采集的样本中均有检出RBoV,提示RBoV在我国鼠形动物中具有广泛的分布。获得了 11条来自褐家鼠和1条来自黄胸鼠的粪便样本近全长的RBoV基因组序列,长度在5110bp和5148bp之间。基于全序的进化树结果显示,本研究中获得的RBoV序列和已报道的RBoV序列聚为一个进化枝,同PBoV和其它动物源的博卡病毒均具有显著的差异。3.4.4腺相关病毒鼠腺相关病毒(Rat AAV)在咽拭子、粪便和血清中检出率分别为 54.7%(267/488)、14.3%(70/488)和 18.4%(41/223)。褐家鼠、黄胸鼠、黄毛鼠和臭鼩鼱均可以携带RatAAV,但是黄毛鼠整体阳性率相对较低。4个省份所采集的样本均有Rat AAV检出,提示RatAAV在我国的鼠形动物中具有广泛分布。基于Cap基因的核酸进化树显示,本研究中获得的AAV序列和已报道的Rat AAV序列相似度较高,与灵长类AAV 1-8型以及其它动物源的AAV差异较大。4.结论4.1初步阐明了我国部分地区褐家鼠和臭鼩鼱的肠道菌群特征以及季节性差异:褐家鼠和臭鼩鼱肠道中均携带大量的致病菌和条件致病菌,其中臭鼩鼱所携带致病菌的丰度高于褐家鼠:不同季节的褐家鼠和臭鼩鼱均携带大量的特有细菌。4.2初步建立了家栖鼠和臭鼩鼱咽部、肠道和血清病毒群落的基线数据库,并发现不同种属(褐家鼠、黄胸鼠和臭鼩鼱)、不同季节(夏秋季和冬春季)以及不同组织(咽部、肠道和血清)的病毒群落存在一定差异。4.3对4种丰度较高的病毒进行分子流行病学分析:①在家栖鼠和臭鼩鼱中发现了新型的鼠细环病毒RoTTV3,其在我国三种常见的鼠科动物(褐家鼠,黄胸鼠和黄毛鼠)中均具有较高的携带率。②首次在家栖鼠和臭鼩鼱中检出猪博卡病毒,且为新型的PBoV4。PBoV4广泛分布于褐家鼠,黄胸鼠和黄毛鼠中,提示鼠科动物在猪博卡病毒的储存、传播以及进化中起着重要的作用。③鼠博卡病毒广泛分布在我国的鼠科动物中,具有较高的感染率,并首次在黄胸鼠中检出了 RBoV,拓宽了对RBoV宿主范围的认识。④首次在我国鼠形动物中开展腺相关病毒的分子流行病学调查,研究结果显示鼠腺相关病毒在我国鼠科动物中广泛的分布,且具有较高的感染率。