目的：　　1分析手足口病(hand，foot and mouth disease，HFMD)重症化的免疫与代谢危险因素和代谢谱的变化及代谢机制，为重症HFMD的早期识别和临床干预提供依据。　　2构建肠道病毒71型(Enterovirus71，EV71)感染重症HFMD乳鼠模型和人清道夫受体B2(Homo sapiens scavenger receptor class B，member2，hSCARB2)基因敲入(knock in，KI)小鼠模型，为重症HFMD发病机制研究提供模型支持。　　3揭示局部器官免疫在EV71感染诱发重症过程中的作用，为重症HFMD的治疗提供理论依据。　　方法：　　1收集2013至2017年4月～9月在郑州市儿童医院和新乡医学院第一附属医院住院治疗的HFMD病例，采用巢式序列病例对照研究分析免疫和代谢指标的变化，应用多元回归模型分析重症HFMD潜在的危险因素。采用LC-MS分析健康对照和EV71阳性病例血清，健康对照血清来自于郑州市中心医院检查的5岁以下健康儿童。通过OPLS-DA模型中的VIP值，结合t检验(两组间)或单因素方差分析(三组间)和两两组别间倍性变化≥1.5或≤0.667的标准筛选差异代谢产物。通过代谢物的生物功能分析，寻找与重症HFMD发生相关的代谢通路和差异代谢产物。　　2通过腹腔、颅内和肌肉注射等三种途径感染3日龄BALB/c乳鼠(2×106pfu/小鼠)，记录临床评分和生存情况。苏木素-伊红(Hematoxylin-Eosin，H&E)染色和尼氏染色观察病理学改变。各组织器官的病毒载量采用VP1免疫组化分析和TCID50测定。线粒体损伤和超微病理采用JC-1荧光探针和透射电镜进行分析。通过感染不同日龄BALB/c乳鼠研究EV71病毒的年龄易感性。Spearman秩相关分析中枢神经系统损伤与肺部病变的关系。采用CRISPR/Cas9技术构建hSCARB2KI小鼠模型，并通过荧光定量PCR、免疫组化和Western blot进行基因和蛋白水平的鉴定。5日龄和1周龄KI小鼠和WT小鼠分别经颅内注射感染EV71(2×106pfu/小鼠)，并记录小鼠感染后的症状和临床评分。　　33日龄BALB/c乳鼠经腹腔注射感染EV71病毒(2×106pfu/小鼠)，感染后第7天(7days post infection，7dpi)计算肺组织的脏器系数，采用流式细胞仪检测外周血和肺组织免疫细胞表型。应用Mouse Inflammation ArrayⅠ试剂盒分析肺组织匀浆上清中细胞因子变化，组织匀浆上清炎症细胞因子及活性物质的检测采用酶联免疫吸附法和Griess法。H&E染色、马松(Masson)和PAS糖原染色观察肺组织病理学改变。通过甲苯胺蓝染色和类胰蛋白酶表达检测组织肥大细胞。Spearman秩相关分析肥大细胞与EV71感染诱发中枢神经损伤和肺水肿的关联。应用蛋白质组和Western blot检测乳鼠脑组织和肺组织的免疫分子。　　结果：　　1单因素分析显示，农村生活(OR=1.89，P=0.005)、高热(＞39℃)(OR=2.40，P=0.014)是重症HFMD的危险因素。对所有发病时间HFMD病例的临床数据进行多元回归分析显示，嗜酸性粒细胞(OR=0.91，P＜0.0001)、Na+(OR=0.74，P=0.0002)和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)(OR=1.06，P=0.02)是重症HFMD的独立影响因素。巢式序列病例对照研究基础上的多元回归分析显示，感染发病第1天，嗜酸性粒细胞(OR=0.80，P=0.02)、Na+(OR=0.53，P=0.02)和肌酸激酶(creatine kinase，CK)(OR=0.82，P=0.008)是重症HFMD的独立影响因素;感染发病第2天，嗜酸性粒细胞(OR=0.69，P=0.04)和Na+(OR=0.52，P=0.03)是重症HFMD的独立影响因素;感染发病第3天，Na+(OR=0.68，P=0.03)是重症HFMD的独立影响因素;感染发病第4天，嗜酸性粒细胞(OR=0.85，P=0.004)、球蛋白(OR=1.54，P=0.002)是重症HFMD的独立影响因素;感染发病≥5天，球蛋白(OR=1.20，P=0.02)是重症HFMD的独立影响因素。　　HFMD重症化进程伴随血清代谢谱的改变，经筛选共得到62个差异代谢物。生物功能分析显示，这些差异代谢物在体内主要涉及的代谢通路有：丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢;三羧酸循环;D-谷氨酰胺、D-谷氨酸代谢;乙醛酸和二羧酸代谢;缬氨酸，亮氨酸和异亮氨酸生物合成;泛酸和辅酶A生物合成;谷胱甘肽代谢。二十二碳六烯酰PAF C-16(AUC=0.85，95％CI：0.77～0.94，P＜0.0001)、二十碳五烯酰PAF C-16(AUC=0.72，95％CI：0.62～0.83，P=0.0004)、α-酮异戊酸(AUC=0.72，95％CI：0.61～0.83，P=0.0006)、L-苯丙氨酸(AUC=0.70，95％CI：0.59～0.82，P=0.001)和鞘氨醇-1-磷酸(AUC=0.70，95％CI：0.58～0.80，P=0.003)的ROC曲线下面积(area under the curve，AUC)大于0.7，是潜在的重症HFMD诊断指标，同时也具有较高的联合诊断效能(AUC=0.90，95％CI：0.83～0.97，P＜0.0001)。血清二十二碳六烯酰PAF C-16(r=0.20，P=0.027)和二十碳五烯酰PAF C-16(r=0.24，P=0.008)水平与白细胞数呈显著正相关。　　2EV71感染乳鼠表现明显的中枢神经系统症状和肺部充血，各组织器官均表现出严重的病理学损伤。相关分析显示，EV71感染引起的中枢神经病变与肺部病变存在显著正相关(JP＜0.05)。EV71感染在体外和体内水平均可引起明显的线粒体肿胀、线粒体嵴减少。乳鼠对EV71的易感性随日龄增加而下降，3日龄BALB/c乳鼠模型可应用于重症HFMD发病机制研究。在构建hSCARB2KI小鼠方面，本研究共得到77只Founder小鼠，经过电泳检测共有10只小鼠出现目的条带。1、4、7周龄KI小鼠各组织hSCARB2mRNA的表达均显示为阳性。7周龄KI小鼠各组织可检测到hSCARB2蛋白的表达。5日龄和1周龄KI小鼠感染EV71后发生中枢神经系统症状和死亡的比例增加。　　33日龄BALB/c乳鼠在7dpi可出现明显的肺水肿。EV71感染导致乳鼠外周血CD4+T淋巴细胞和CD8+CD69+T淋巴细胞比例显著升高(P＜0.01)和CD8+T淋巴细胞比例显著下降(P＜0.01)。同时，树突状细胞比例、CD11b+MHCⅡ+树突状细胞比例和CD11b-MHCⅡ—树突状细胞比例在7dpi均显著下降(P＜0.05)，而CD11b+MHCⅡ—树突状细胞比例显著上升(P＜0.01)。与对照组相比，EV71组肺组织裂解液中嗜酸性粒细胞趋化因子(eosinophil chemotactic factor,Eotaxin)-1、Eotaxin-2、细胞间粘附分子(intercellular adhesion molecule，ICAM-1)、白介素(interleukin，IL)-7、IL-13、IL-17的表达水平显著升高(P＜0.05)，而粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony stimulating factor,G-CSF)、干扰素(interferon，IFN)-γ、IL-10表达水平显著下降(P＜0.05)。EV71感染导致脑、肺和骨骼肌中肥大细胞增多和活化，肺组织表现严重的炎症反应。EV71感染后肺组织T淋巴细胞、树突状细胞和单核细胞群数量减少，嗜酸性粒细胞、调节性T淋巴细胞和肥大细胞数量增多。同时，T淋巴细胞存在向Th2型分化的趋势。　　结论：　　1农村生活和高热，嗜酸性粒细胞数量减少和球蛋白水平升高等免疫指标变化与ALP水平升高、Na+和CK下降等代谢指标变化是重症HFMD的危险因素。HFMD重症化伴随着血清代谢谱的变化和能量代谢紊乱，二十二碳六烯酰PAF C-16、二十碳五烯酰PAF C-16、α-酮异戊酸、L-苯丙氨酸和鞘氨醇-1-磷酸是潜在的重症HFMD诊断指标，二十二碳六烯酰PAF C-16和二十碳五烯酰PAF C-16两种磷脂可能参与重症HFMD的发生发展。　　2EV71感染导致乳鼠出现中枢神经病变和肺部病变，肺部病变的发生可能与中枢神经系统损伤有关。本研究构建的KI小鼠模型更加高效、经济和稳定，未来可推广应用于EV71感染发病机制和疫苗的研发。　　3EV71感染通过诱导外周血和肺组织T淋巴细胞免疫应答和树突状细胞减少、肥大细胞活化、炎症、脑组织天然免疫应答以及肺组织的天然免疫逃逸等免疫机制促进中枢神经系统损伤和肺水肿的发生。