【摘 要】
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大豆是我国重要的经济作物之一,受大豆胞囊线虫病的影响,大豆的品质和产量会急剧下降。因此,防治刻不容缓。目前生产应用的防治方法有物理、化学、生物防治等,但最经济有效的方法就是培育抗病品种。大豆胞囊线虫二龄幼虫需要突破根部细胞细胞壁,在根内寻找合适的位置进行定殖。有研究表明,在线虫侵染前后木质素合成通路较为活跃。木质素是次生细胞壁的主要成分之一。肉桂酸-4-羟化酶(C4H)和漆酶(Lac)是木质素合成
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大豆是我国重要的经济作物之一,受大豆胞囊线虫病的影响,大豆的品质和产量会急剧下降。因此,防治刻不容缓。目前生产应用的防治方法有物理、化学、生物防治等,但最经济有效的方法就是培育抗病品种。大豆胞囊线虫二龄幼虫需要突破根部细胞细胞壁,在根内寻找合适的位置进行定殖。有研究表明,在线虫侵染前后木质素合成通路较为活跃。木质素是次生细胞壁的主要成分之一。肉桂酸-4-羟化酶(C4H)和漆酶(Lac)是木质素合成途径的关键酶和终端酶,对木质素的合成有重要作用。目前对关键酶的研究更多集中在植物应对非生物胁迫,对生物胁迫的研究较少。本论文从木质素影响细胞壁进而影响大豆对大豆胞囊线虫的抗性出发,围绕SCN胁迫下C4H、Lac55、Lac85的表达和木质素的响应情况及转化大豆后成功侵染的线虫数量等方面,探究了相关酶基因的表达响应,以及转化大豆后对大豆对大豆胞囊线虫的抗性的影响。本研究为抗病品种的培育奠定理论基础。主要研究结果如下:1.将SCN3接种于感病品种Williams 82和抗病品种小粒黑豆的根部。接种后第5天,进行根染色。结果显示SCN3的二龄幼虫可成功侵染抗感品种根部。2.对供试植株人工接种2000条J2/株,在接种后不同时间提取根、茎、叶总RNA进行实时荧光定量PCR检测。结果显示:根中GmC4H、GmLac55和GmLac85的表达量分别在1dpi、5dpi、9dpi和10dpi显著高表达。初步推测:GmLac55可能在线虫侵染和定殖时起作用,GmLac85可能在线虫定殖阶段有限制作用。同步对抗感品种的茎和叶进行qPCR检测。结果显示:在接种线虫后的不同时间点,GmC4H、GmLac55和GmLac85在茎和叶中的表达量都有不同程度的上调,且和根中高表达的时间点是相同的或者相近的。说明在大豆胞囊线虫侵染大豆根部后,植株整体均产生胁迫应答。3.接种SCN3后对供试植株根部进行木质素染色和含量测定。结果显示:在接种线虫后,抗感品种根部木质素含量发生了变化,改变了大豆对胞囊线虫的抗性。4.利用无缝克隆技术构建GmC4H、GmLac55和GmLac85用于烟草瞬时转化和大豆发根遗传转化的植物过表达载体。亚细胞定位结果显示,GmC4H、GmLac55和GmLac85均定位在细胞膜或细胞壁上,可能对大豆抵御大豆胞囊线虫胁迫有重要作用。5.对成功转化的大豆进行q PCR鉴定。结果表明:在转化成功的发状根内,GmC4H、GmLac55和GmLac85的表达量有不同程度的上调。GmC4H、GmLac55和GmLac85成功在大豆体内过表达。对植株OE-Lac55进行抗线虫能力的鉴定,成功侵染的线虫数量显著低于抗病品种小粒黑豆,而且J2向J3和J4转化的比例有降低。试验结果表明GmLac55可能在限制线虫入侵和在根内的发育中都发挥了重要的作用。
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