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p-葡萄糖苷酶广泛存在于各种生物体中,它能水解结合于末端非还原性的p-D-葡萄糖苷键,可以应用于茶酒增香,转化大豆异黄酮糖苷,生产低聚龙胆糖,以及降解纤维素。然而,游离p-葡萄糖苷酶价格昂贵、回收困难、稳定性差且难以重复使用,这些缺陷限制了它在工业领域的广泛应用。本研究以p-葡萄糖苷酶的固定化为中心,分析不同的固定化载体和方法对固定化效果的影响。运用响应面法优化固定化酶的制备条件,并对最佳工艺下制备的固定化p-葡萄糖苷酶的酶学性质进行了研究,重点探讨了其固定化机理。基于各种表征结果分析,揭示了载体结构和酶的固定化效率之间的关系。同时,自制了效果显著的实验用沸腾床反应器,应用于大豆异黄酮的连续生物转化并对其转化效果进行评价,为固定化β-葡萄糖苷酶的工业化应用奠定了理论基础。主要研究结果如下：1、以壳聚糖小球为载体,以戊二醛为交联剂,运用交联-吸附-交联法固定化p-葡萄糖苷酶,首次使用响应面法对固定化酶的制备条件进行了优化。在单因素结果分析的基础上,利用Minitab15软件,通过因子设计,筛选出两个显著性因素：载酶量和吸附时间；然后运用响应面法进一步优化得到最佳载酶量为67.15μg/mL,最佳吸附时间为5.54 h,验证实验结果(50.81%)与预测最大固定化酶活力回收率(50.75%)高度一致。对游离β-葡萄糖苷酶和壳聚糖小球固定化酶的酶学性质进行研究,结果表明：固定化p-葡萄糖苷酶具有比游离酶更好的酶学性质,如更广泛的pH值和温度范围、增强的热稳定性、较高的底物可及性和更好的贮存稳定性。此外,固定化p-葡萄糖苷酶还展现了卓越的操作稳定性。2、首次利用Fe304磁性纳米颗粒作为载体,运用交联法固定化β-葡萄糖苷酶。基于单因素试验的研究结果,运用响应曲面法,进一步优化经柠檬酸修饰的磁性纳米颗粒固定化p-葡萄糖苷酶的制备条件,确定最佳固定化条件为：戊二醛浓度为0.20%,酶液浓度为50.25μg/mL,交联时间为2.21 h,预测固定化酶的最大活力回收率为89.35%,与验证实验结果(90.46%)十分接近。对游离p-葡萄糖苷酶及其固定化酶的酶学性质进行研究,结果表明：固定化技术拓宽了p-葡萄糖苷酶的反应温度范围；固定化p-葡萄糖苷酶比游离酶具有更宽的pH范围、更高的热稳定性、更好的底物可及性和更强的贮藏稳定性；在永恒磁场的作用下,磁性纳米颗粒固定化β-葡萄糖苷酶可以简单有效的实现酶的分离回收,且具有很好的操作稳定性。对Fe304磁性纳米颗粒固定化p-葡萄糖苷酶进行二次固定化后,仍具有较高的酶活力回收率(88.42%)。3、首次采用介孔分子筛为载体,运用不同的固定化载体和方法对p-葡萄糖苷酶进行固定化,结果表明,介孔分子筛的空间结构和固定化方法对固定化酶的活力回收率都有一定的影响。与SBA-15-1000固定化酶相比,MCM-41对β-葡萄糖苷酶的固定化效果更好；吸附-交联法固定化β-葡萄糖苷酶的效果优于直接吸附法,说明分子筛的孔道结构不同,其固定化p-葡萄糖苷酶的效率也存在差异。基于单因素实验的分析结果,运用响应面法进一步优化介孔分子筛MCM-41固定化p-葡萄糖苷酶的制嵛：工艺,获得最佳固定化条件为：戊二醛浓度为0.63%,酶液浓度为41.821μg/mL,交联时间是2.55 h,相应固定化β-葡萄糖苷酶活力回收率的实验值高达133.72%,比优化之前的活力回收率(91.74%)提高了45.76%。4、研究最佳工艺下制备的MCM-41固定化β-葡萄糖苷酶的酶学性质,结果表明,游离p-葡萄糖苷酶与固定化酶的最适pH值和最适温度均相同,然而MCM-41固定化p-葡萄糖苷酶比游离酶具有更强的pH和温度适应性；经过10次重复操作后,固定化p-葡萄糖苷酶仍然保留很高的酶活力；固定化酶比游离酶具有更强的热稳定性、更好的底物可及性和更高的贮藏稳定性。对MCM-41固定化β-葡萄糖苷酶进行二固定化后,其活力回收率基本不变。MCM-41的孔道结构提供了适宜p-葡萄糖苷酶固定化的微环境,使酶的稳定性和实用性都得到了改善。5、利用不同的表征方式,分别分析了β-葡萄糖苷酶固定在磁性纳米颗粒和MCM-41内的作用机理。通过磁性纳米颗粒及其固定化p-葡萄糖苷酶的红外光谱(FT-IR)分析,证明p-葡萄糖苷酶成功吸附到了磁性纳米颗粒载体上；透射电镜(TEM)分析表明,磁性纳米颗粒及其固定化β-葡萄糖苷酶均为纳米级粒径分布,分散性好,且酶的固定化并没有影响磁性纳米颗粒的稳定性；振动样品磁强计(VSM)分析说明,磁性纳米颗粒及其固定化酶均具有超顺磁性。根据FT-IR和X-衍射(XRD)分析,证明p-葡萄糖苷酶成功的吸附到载体MCM-41上,且β-葡萄糖苷酶的固定化未改变载体MCM.-41的基本结构；扫描电镜(SEM)分析说明,MCM-41与固定化p-葡萄糖苷酶的形态相似,固定化后MCM-41的分散性更好,有助于固定化酶的催化反应；N2吸附实验结果显示,MCM-41及其固定化p-葡萄糖苷酶均具有较窄孔径分布的介孔结构；比表面积和孔径分布分析表明,固定化p-葡萄糖苷酶后MCM-41的孔径、孔容和比表面积均减小,说明固定化后MCM-41内有p-葡萄糖苷酶存在；元素分析结果进一步证实了β-葡萄糖苷酶已经固定到载体MCM--41上。7、将不同载体固定化的p-葡萄糖苷酶应用于大豆异黄酮的间歇式生物转化,采用高效液相色谱法分析大豆苷的转化率和大豆苷元的产量。结果表明,磁性纳米颗粒和MCM-41固定化β-葡萄糖苷酶的生物转化效果与游离p-葡萄糖苷酶相近,可达到93%以上；壳聚糖固定化酶的转化率约为70%；二次固定化后磁性纳米颗粒和MCM-41固定化p-葡萄糖苷酶的转化率达到85%以上。自制实验用沸腾床反应器,利用氮气推动固定化β-葡萄糖苷酶小球循环翻滚,将磁性纳米颗粒二次固定化酶应用于大豆异黄酮溶液的循环生物转化,连续酶解10次后,大豆苷的转化率依然保持在80%以上,表明该固定化p-葡萄糖苷酶应用沸腾床反应器连续生物转化大豆异黄酮的稳定性好,且应用性强。