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病毒性心肌炎(Viral myocarditis，VM)是儿童心血管疾病中最为常见的疾病,其通常由柯萨奇病毒B3型(Coxsackie virus B3, CVB3)引起,由于治疗方案的不断完善与改进,其治愈率较前明显提高,但仍有部分患儿对治疗存在不敏感或是复发,临床预后欠佳。临床及循证医学研究表明,柯萨奇B组病毒感染导致的病毒对心肌细胞的直接损伤及后续的持续免疫损伤是造成病毒性心肌炎难以完全治愈的根本原因,同时也是部分患儿反复复发的根结。因此,不断发掘新的药物及新的治疗方法,给予患儿有目的、有针对性的治疗对提高患儿的治愈率有重要意义。GYY4137是一种新型的硫化氢(Hydrogen sulfide, H2S)缓释剂,其具有水溶性,能够缓慢释放气体分子硫化氢(H2S),其是吗啉代二硫代磷酸酯二氯甲烷复合物((p-methoxyphenyl)morpholino-phosphinodithioic acid),具有抗炎症、抗凋亡、保护血管等多种生物学效应,被誉为是继一氧化氮(Nitric oxide,NO)及一氧化碳(Carbon monoxide, CO)后的第三种气体信使分子。国外学者研究发现,GYY4137在脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)引起的小鼠巨噬细胞炎症模型中,呈现出抑制细胞炎症因子的分泌,调控炎症相关基因及蛋白的表达,发挥出抗炎症反应的效应。与此同时,相关研究亦发现,在大鼠多个器官缺血缺氧再灌注损伤模型中,GYY4137不仅呈现出抑制炎症反应的效应,而且还发挥出抗细胞凋亡的生物学效应。而病毒性心肌炎是由柯萨奇病毒引起的心肌细胞直接损伤及后续的持续免疫损伤,并伴随着心肌细胞的凋亡,最终导致心脏结构与功能的改变。据此,我们推测GYY4137可能会对柯萨奇病毒引起的病毒性心肌炎具有一定的保护作用。本项研究首先建立了病毒性心肌炎体外模型,并从形态学、生理生化等方面验证模型的成功性与可靠性,在该模型的基础上给予了新型硫化氢缓释剂GYY4137,通过对生理生化指标的测定以及检测炎症相关因子及其上游调控蛋白的表达,来探究GYY4137对感染了柯萨奇病毒的乳鼠心肌细胞的保护作用；并进一步探究了该保护作用与细胞信号转导通路之间的关系,以期阐明GYY4137对VM保护作用的机制。第一部分柯萨奇病毒B3型感染SD大鼠乳鼠心室肌细胞模型的建立与鉴定目的：培养原代乳鼠心肌细胞,成功建立柯萨奇病毒感染介导的病毒性心肌炎体外模型,进一步从心肌细胞分子生物学和病理生理学的角度,为探究病毒性心肌炎病毒损伤心肌细胞阶段的发病机理奠定研究基础。方法：采用双酶消化法培养新生SD大鼠乳鼠原代心肌细胞,并予以浓度为100TCIDso柯萨奇病毒B3型感染原代乳鼠心肌细胞,建立病毒性心肌炎体外模型,观察感染后心肌细胞的病变、搏动频率、并用细胞免疫荧光法来鉴定心肌细胞的纯度,运用RT-PCR方法扩增出CVB3的特异性条带。结果：原代培养的SD大鼠乳鼠心肌细胞经HE染色、α-SMA细胞免疫荧光化学染色后确定其为心肌细胞且纯度达95%以上,在感染了予以柯萨奇病毒B3型后,心肌细胞逐渐出现了细胞病变,细胞搏动减慢直至停止,心肌细胞培养上清液中乳酸脱氢酶(LDH)及肌酸激酶(CK-MB)的含量显著升高,RT-PCR扩增出了CVB3的特异性条带。结论：柯萨奇病毒感染介导的病毒性心肌炎体外模型被成功构建,并保证了其可靠性与稳定性,该模型为体外研究病毒性心肌炎奠定了基础。第二部分GYY4137对感染柯萨奇病毒B3型乳鼠心肌细胞的保护作用及对炎性因子分泌的影响目的：研究GYY4137对感染柯萨奇B3型病毒(CVB3)心肌细胞的保护作用,并探讨其对炎性因子IL-6、IL-1β、TNF-α分泌的影响,为GYY4137应用于临床治疗病毒性心肌炎提供理论依据。方法：培养乳鼠原代心肌细胞,建立病毒性心肌炎(viral myocarditis,VMC)体外模型,随机分为正常组、模型组、模型组+10umol/L GYY4137、模型组+50umol/L GYY4137、模型组+100umol/L GYY4137。培养48h后,留取各组心肌细胞培养上清液,采用化学比色法分别检测心肌细胞培养上清液中乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK-MB)的含量；Elisa法检测各组IL-6、IL-1β、TNF-α的表达水平。上述各组细胞培养至第5天,采用CCK-8法测定各组心肌细胞的活力。结果：与正常组比较,模型组在感染病毒48h后其心肌细胞病变程度较其余4组明显,LDH及CK-MB浓度显著升高(p<0.05),炎性因子IL-6、IL-1β、TNF-α的表达水平亦显著升高(p<0.01),与模型组比较,模型组+10umol/L GYY4137、模型组+50umol/L GYY4137.模型组+100umol/L GYY4137,其IL-6、IL-1β、TNF-α及CK-MB表达明显降低,差异具有统计学意义(p<0.05)。结论：GYY4137对正常心肌细胞的活力没有影响,其对心肌细胞不具有细胞毒性作用,其能降低CVB3对心肌细胞的损伤、抑制柯萨奇B3病毒感染大鼠心肌细胞的炎性细胞因子的释放。第三部分GYY4137对感染柯萨奇病毒B3型乳鼠心肌细胞的NF-B及MAPK信号转导通路敏感性及机制的研究目的：在病毒性心肌炎CVB3感染心肌细胞的体外模型中,观察NF-κB及MAPK信号转导通路相关蛋白的表达及GYY4137对上述信号转导通路相关蛋白的表达的影响。本研究将探讨在CVB3感染心肌细胞的病毒性心肌炎体外模型中GYY4137对NF-κB及MAPK信号转导通路相关蛋白的作用,以进一步阐明GYY4137在病毒性心肌炎体外模型中发挥抗炎症效应的机制。方法：培养乳鼠原代心肌细胞,建立病毒性心肌炎(viral myocarditis,VMC)体外模型,随机分为正常组、模型组、模型组+10umol/L GYY4137.模型组+50umol/L GYY4137,模型组+100umol/L GYY4137。上述各组细胞分别培养至6h、12h、24h,采用Western Blot法检测MAPK信号转导通路相关蛋白ERK1/2、 P-ERK1/2; P38、 P-P38; JNK1/2、 P-JNK1/2的表达及NF-κB信号转导通路相关蛋白IκBα NF-κB p65的表达,并运用EMSA法检测心肌细胞核蛋白NF-κB P65表达情况,同时运用细胞免疫荧光及激光共聚焦法检测心肌细胞核蛋白NF-κB p65在心肌细胞转位情况。结果：与正常组比较,模型组在感染病毒6h后,其MAPK信号转导通路相关蛋白ERK1/2、P38、JNK1/2的磷酸化水平显著增加(p<0.05),而予以不同浓度的GYY4137处理,显著降低了ERK1/2、 P38、 JNK1/2的磷酸化水平(p<0.05)；此外,模型组中IκBα被激活,其降解显著增加(p<0.05)使得胞浆上的NF-κB p65向胞核转位导致胞核NF-κB p65显著增加(p<0.05),而GYY4137则呈浓度梯度地抑制这一过程,EMSA结果也证实了这一过程,与此同时,通过激光共聚焦的结果,使得我们更加直观地观察到了在病毒性心肌炎体外模型中GYY4137抑制了NF-κB p65从胞浆到胞核的转位。结论：在病毒性心肌炎体外细胞模型中,MAPK信号转导通路相关蛋白ERK1/2、 P38、 JNK1/2被激活,其磷酸化水平显著增加；NF-κB信号转导通路相关蛋白IκBα被激活,IκBα发生降解,其蛋白表达显著降低,细胞浆NF-κB p65蛋白表达降低,而胞核NF-κBp65蛋白表达显著升高,GYY4137呈浓度梯度地抑制了ERK1/2、 P38、 JNK1/2的磷酸化水平及NF-κB p65从胞浆到胞核的转位,这为GYY4137用于治疗病毒性心肌炎提供了初步的理论依据。第四部分GYY4137对感染柯萨奇病毒B3型乳鼠心肌细胞凋亡的保护作用及机制的研究目的：在病毒性心肌炎CVB3感染心肌细胞的体外模型中,观察凋亡信号通路相关蛋白Bcl-2/Bax/Cleaved-caspase3的表达及GYY4137对上述凋亡信号通路相关蛋白的表达的影响。本研究将探讨在CVB3感染心肌细胞的病毒性心肌炎体外模型中GYY4137对凋亡信号转导通路相关蛋白Bcl-2/Bax/Cleaved-caspase3表达的影响,以进一步阐明GYY4137在病毒性心肌炎体外模型中发挥抗凋亡效应的机制。方法：培养SD大鼠乳鼠原代心肌细胞,建立病毒性心肌炎(VMC)体外模型,随机分为正常组、模型组、模型组+50umol/l GYY4137、正常组+50umol/l GYY4137。Hoechst33342对各组细胞进行染色,检测大鼠乳鼠心肌细胞凋亡,TBA法及酶标法分别检测各组细胞上清中丙二醛(MDA)、超氧化物岐化酶(SOD)的表达,Western-blot法检测各组细胞bcl-2/bax/cleved-caspase3蛋白的表达,Annexin V-FICT/PI双染法检测各组心肌细胞凋亡情况。结果：1.与正常组比较,模型组心肌细胞凋亡明显增加(P<0.01)；给予50umol/lGYY4137后,心肌细胞凋亡明显好转(P<0.01)；而单纯给以50umol/l GYY4137对正常心肌细胞无明显影响。2.与正常组比较,模型组心肌细胞MDA显著增加、SOD显著降低(P<0.05),给予50umol/1GYY4137后,心肌细胞MDA显著降低、SOD明显增加(P<0.05)；而单纯给予50umol/1GYY4137对正常心肌细胞MDA.SOD无明显影响(P>0.05)。3.与正常组比较,模型组心肌细胞Bcl-2蛋白表达降低、Bax蛋白表达明显增加(P<0.05)、 Cleved-caspase3蛋白显著增高(P<0.01)；给予50umol/1GYY4137后,心肌细胞Bcl-2蛋白表达增加、Bax蛋白表达明显降低(P<0.05)、 Cleved-caspase3蛋白显著减低(P<0.01)；单纯给予50umol/1GYY4137对正常心肌细胞Bcl-2蛋白、Bax蛋白、Cleved-caspase3蛋白表达无明显影响(P>0.05)。结论：GYY4137可显著改善柯萨奇病毒B3引起的大鼠乳鼠心肌细胞凋亡,其作用机制与抑制Bcl-2/Bax/Cleaved-caspase3信号通路激活及抑制氧化应激机制有关。