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水稻既是重要的粮食作物也是单子叶植物生物学研究的模式材料,随着水稻功能基因组学研究的深入及分子操作技术的成熟,有效解读水稻内源基因生物功能,进而进行有效的分子育种日益成为可能。细胞分裂素(cytokinin,CTK)是植物生长发育过程必不可少的激素成分,细胞分裂素氧化/脱氢酶(cytokinin oxidases/dehydrogenase,CKX)通过降解细胞分裂素,有效调控植物内源细胞分裂素水平,是细胞分裂素信号通路中降解分支的关键酶。水稻全基因组中注释了11个CKX基因,已有研究揭示了其中部分基因对水稻生长的调控作用,但因为缺乏明确的突变体材料,水稻OsCKX基因家族具体成员的生物功能所至有限。本文应用CRISPR-Cas9、CRISPR-Cas12a基因组编辑技术,以日本晴为模式材料,针对OsCKX基因家族成员进行定向敲除,创制OsCKX1~OsCKX11单基因及多基因定向敲除突变体材料,为系统研究OsCKX基因家族不同成员生物功能及有效进行分子育种奠定基础。本文主要研究内容及结果如下:1.基于CRISPR-Cas9核酸酶编辑系统向导RNA(single guide RNA,sgRNA)设计标准,针对OsCKX1~OsCKX11基因编码区扫描5’-NGG-3’三核苷酸PAM位点,选取PAM上游20 bp DNA序列作为sgRNA识别区域,构建OsCKX1~OsCKX11定向敲除编辑载体,进而基于农杆菌介导的遗传转化导入水稻受体材料,在抗性再生材料中筛选鉴定定向敲除突变体材料。实验结果表明,除OsCKX1-sgRNA1位点外,针对不同OsCKX基因家族成员构建的CRISPR-Cas9编辑载体显示明确的编辑活性,不同位点编辑效率从27.3%(OsCKX1-sgRNA2)到100%(OsCKX3-sgRNA1)不等。考虑到潜在的无活性sgRNA位点,实验采取了双sgRNA设计策略,有效确保了OsCKX基因家族成员定向敲除突变体的创制效率;2.基于CRISPR-Cas12a核酸酶编辑系统向导RNA(crRNA)设计标准,针对OsCKX1~OsCKX11基因编码区扫描5’-TTTV-3’四核苷酸PAM位点,选取PAM下游23 bp DNA序列作为crRNA识别区域,构建OsCKX1~OsCKX11定向敲除编辑载体,并进行遗传转化、再生及突变体筛选鉴定。实验结果表明,CRISPR-Cas12a核酸酶编辑系统稳定性一定程度上优于CRISPR-Cas9核酸酶编辑系统,所有构建的CRISPR-Cas12a编辑载体均显示明确的编辑活性,编辑效率从23.1%(OsCKX5-crRNA)到100%(OsCKX8-crRNA)不等;3.针对筛选鉴定的OsCKX基因家族不同成员定向敲除突变体T0单株,收获其自交所得T1材料进一步进行基因分型鉴定,统计结果表明,T1分离材料基因型符合孟德尔遗传规律,所获得OsCKX突变可以稳定遗传。进一步对T1定向敲除突变体生长表型进行分析,发现OsCKX1、OsCKX6、OsCKX7敲除突变体材料籽粒变大,表现出一定的增产潜力。4.水稻OsCKX基因家族成员间相似度较高,为了有效避免基因冗余性干扰,进一步明确OsCKX基因家族不同成员生物功能,针对亲缘关系较近的OsCKX基因家族成员,基于CRISPR-Cas12a基因编辑体系构建多基因定向敲除载体,创制OsCKX多基因聚合突变体材料。