背景和目的通过炎症,创伤或肿瘤造成的牙周支持组织的水平缺损的重建在临床上依然是一个难题。用组织工程学方法促进牙槽骨再生修复牙周疾病引起的牙周组织缺损是近年来的研究热点。骨组织工程主要的瓶颈是形成的组织工程骨与天然的生理骨仍有很大差距。可能的主要原因是没有实现组织工程骨的神经化。生长因子在骨形成过程起很重要的作用,这主要是通过刺激间充质干细胞向硬组织方向的分化。在过去的几年里,多种生长因子具有骨再生潜力,包括成纤维细胞生长因子,血小板衍生因子,胰岛素样生长因子,转化生长因子,血管内皮细胞生长因子,和骨形成蛋白(BMP)。在这些因子中,重组人骨形成蛋白2(rhBMP2)是促进牙周组织再生的最具潜力的因子。除了它可以促进再生骨的量之外,它还可以安全的应用到病人身上,在rhBMP2处理的区域可以形成正常的骨。但是rhBMP2形成的骨的质量并不那么完美。最主要的缺陷是rhBMP2刺激再生的骨具有比较低的临床愈合能力,机械性能比较差,还有异位成骨。这些异常阻碍了它对大的骨缺损的临床应用。因此找到新的方法来改善再生骨的质及量非常必要。越来越多的证据表明神经系统和骨的形成,修复和改建密切相关。正常骨组织中有广泛的肽能神经分布,尤其在成骨活动活跃区域,新生骨组织中神经支配的现象更为显著。在人长骨不连患者中,发现在局部组织中存在神经纤维缺失的现象,并认为失神经支配可能是影响骨折正常愈合的原因之一。在截瘫和颅脑外伤伴有四肢骨折的患者中,往往发现骨折骨痂异常增大,甚至出现关节周围异位骨化现象,然而在动物失神经实验研究中,虽然证实骨痂形成加快且明显增大,但骨痂密度不规则,骨痂力学强度明显减弱。在下牙槽神经切断的大鼠中,牙槽骨的改建活动被抑制。而rhBMP2再生的骨和这些具有神经损伤的病人或实验动物具有相似的表现。我们的假说是能够调节神经系统的神经来源的生长因子可能也会影响骨的改建。神经生长因子(NGF)是一种重要的神经营养蛋白,可以促进神经的生长分化,最近也被报道它可以促进骨的改建活动,并且在骨折愈合过程起重要作用。另外,它还可以促进人牙周韧带细胞骨及牙骨质相关蛋白,骨桥蛋白和碱性磷酸酶的表达,并且它还调节血管内皮细胞和牙周韧带细胞的增殖和分化,这表明它在体内促进牙周组织再生的潜力。综上所述,这些之前的研究表明NGF在促进新骨生成及改建方面可能有效。因此,本研究将rhBMP2和NGF局部联合应用到比格犬三度根分叉缺损处,观察再生骨的质与量,并观察再生牙周组织中神经纤维的形态和分布。方法第一部分：本实验在六条比格犬的下颌2,3,4前磨牙建立了36个炎性三度根分叉缺损模型。rhBMP2和rh β-NGF通过可吸收的凝胶局部应用到牙周缺损处。按拉丁方设计将36颗实验牙分为6组,分别为：A空白对照组作为对照组A,B空白凝胶组作为对照组B,C凝胶+0.4%(4μ/ml)rhBMP-2,D凝胶+2%(20μg/ml)rhNGF,E凝胶+0.4%(4μ/ml) BMP-2+2%(20μg/ml)rhNGF,F凝胶+0.2%(2μg/ml)rhBMP-2+1%(10μg/ml)rhNGF。八周后处死动物,再生牙周组织的质和量通过扫描电镜,钙磷比例及组织学测量进行观测。第二部分：本实验动物手术部分同第一部分。标本处理采用冰冻切片,通过PGP-9.5免疫组织化学染色方法观察比格犬下颌前磨牙三度根分叉缺损再生牙周膜中神经的量,形态及分布情况。结果第一部分：实验结果证明骨形成蛋白2单独应用就可以促进再生骨的量。NGF单独应用组可以观察到更多的新骨生成伴随更高的钙磷比值。另外,扫描电镜观察显示在这一组中新生的组织中胶原束的直径比对照组中的高。骨形成蛋白2和神经生长因子联合应用的两组比两个对照组可以观察到更高的钙磷比值,并且伴有胶原纤维表明的更多的钙化物。另外,两种生长因子的联合应用比任何一种因子的单独应用促进更多面积的骨生成和更多的牙骨质,两种生长因子对牙周组织再生存在协同作用。第二部分：PGP9.5免疫组织化学染色阳性的纤维可以在所有再生牙周膜中观察到。但是它们的数目比较少而且大部分分布比较分散。再生牙周膜中切迹区域PGP9.5阳性区域对此区域的牙周膜面积(除去牙齿,牙槽骨和血管)的百分比(POP)为1.93±0.92%,明显低于正常对照(3.09±1.12%)。再生的鲁菲尼小体仅仅在17个标本中的3个观测到。与正常牙周膜中的鲁菲尼小体相比,再生牙周膜中的具有更少的分支。细的自由神经末梢在再生牙周膜中占主导地位。它们大多数外形平滑,末端逐渐变细不形成任何末梢。另外,再生的牙周膜中牙周韧带在牙槽骨和牙骨质的附着比较松散。大多数再生的神经纤维和血管相邻,有些是沿牙周胶原纤维排列。有时在牙周组织改建活跃的区域可以看到神经的生长。结论局部应用rhBMP2和rhβ-NGF可能会促进比格犬的三度炎性根分叉缺损再生骨的质和量。鲁菲尼小体在再生牙周膜中较少观察到,神经组织可能参与到牙周组织的改建。