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第一章Fas、Fas配体(FasL)和诱骗受体3(DcR3)在人垂体腺瘤组织中的表达目的检测Fas、Fas配体(FasL)和诱骗受体3(DcR3)的蛋白和mRNA在人各内分泌类型垂体腺瘤组织中的表达水平。方法分别应用免疫组织化学染色法(IHC)和逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测98例垂体腺瘤组织中Fas、FasL和DcR3的蛋白,及24例垂体腺瘤组织中Fas、FasL和DcR3的mRNA的表达水平,并比较它们各自在正常垂体与垂体腺瘤之间、各种内分泌类型垂体腺瘤之间、以及侵袭性与非侵袭性垂体腺瘤之间表达水平的差异。结果1、免疫组化染色显示,Fas蛋白、DcR3蛋白在垂体腺瘤组织中的表达分布于细胞浆和细胞膜中。FasL蛋白在垂体腺瘤组织中未见明显表达。Fas蛋白在垂体腺瘤组织中的表达水平高于DcR3蛋白在垂体腺瘤组织中的表达水平。Fas蛋白及DcR3蛋白在功能性腺瘤组织中的表达水平高于其在无功能腺瘤组织中的表达水平。在功能性腺瘤组织中,Fas蛋白的表达水平高于DcR3蛋白的表达水平。Fas蛋白及DcR3蛋白在侵袭性腺瘤组织的表达水平与其在非侵袭性腺瘤组织的表达水平无明显差别。2、RT-PCR分析显示,Fas mRNA和FasL mRNA在正常垂体组织中均有表达,DcR3 mRNA在正常垂体组织中未见表达。Fas mRNA和DcR3 mRNA在垂体腺瘤组织中均有表达,FasL mRNA在垂体腺瘤组织中未见表达。Fas mRNA在各内分泌类型垂体腺瘤组织中的表达水平均低于其在正常垂体组织中的表达水平。Fas mRNA在各内分泌类型垂体腺瘤组织中的表达水平高于DcR3 mRNA在相应内分泌类型垂体腺瘤组织中的表达水平。Fas mRNA在各内分泌类型侵袭性腺瘤和非侵袭性腺瘤中的表达水平无明显差别。DcR3 mRNA在各内分泌类型侵袭性腺瘤和非侵袭性腺瘤中的表达水平亦无明显差别。结论我们首次证实,从人类正常垂体到垂体腺瘤组织,出现Fas表达水平的下降、FasL表达的缺失、以及DcR3的表达。这些受体和配体表达水平的变化可能在垂体腺瘤的发生发展中起着重要作用。Fas有望作为垂体腺瘤生物治疗的一个新靶点,为外源性FasL治疗垂体腺瘤提供了新的思路。第二章Fas配体(FasL)和RGD-Fas配体(RGD-FasL)对垂体腺瘤细胞的生长抑制作用及其作用机制的研究目的探讨Fas配体(FasL)和RGD-Fas配体(RGD-FasL)对垂体腺瘤细胞生长的影响及其可能的作用机制。方法1、人工构建重组FasL基因和重组RGD-FasL基因,获得纯化的FasL蛋白和RGD-FasL蛋白。2、体外培养大鼠垂体腺瘤细胞系GH3和MMQ,及小鼠垂体腺瘤细胞系AtT20。应用RT-PCR法及流式细胞法检测Fas和DcR3在垂体腺瘤细胞的表达。3、在不同时间经不同浓度的FasL和RGD-FasL干预后,进行以下实验:(1)MTT法观察腺瘤细胞的生长抑制效应;(2)应用倒置显微镜和电镜观察腺瘤细胞的凋亡现象;(3)琼脂糖凝胶电泳观察DNA裂解片段;(4)应用流式细胞仪(FCM)进行细胞周期分析(PI染色);(5)应用Western blot法检测凋亡相关基因Caspase-8、Caspase-9、Caspase-3、RANKL、JNK2和Bcl-2的蛋白水平。(6)Caspase抑制实验验证RGD-FasL诱导细胞凋亡的机制。结果1、人工获得了纯化的FasL蛋白和RGD-FasL蛋白。2、RT-PCR分析和流式细胞法证实了Fas和DcR3在垂体腺瘤细胞的表达。但在GH3细胞中Fas的表达水平较低,在AtT20细胞中DcR3的表达水平很低。3、MTT实验揭示了RGD-FasL对垂体腺瘤细胞的抑制效应等同于FasL。两者的生长抑制效应表现为剂量和时间依赖关系和线性正相关。AtT20细胞对药物的敏感性相对较高,MMQ细胞对药物的敏感性次之,而GH3细胞对药物的敏感性相对较差。4、经RGD-FasL处理的腺瘤细胞发生了典型的凋亡形态学变化。5、琼脂糖凝胶电泳显示,DNA裂解片段出现一个典型的梯形条带,证实了腺瘤细胞的凋亡。6、RGD-FasL和FasL均可诱导细胞周期停滞,凋亡指数(AI)显著上升,处于G0/G1期和G2/M期的细胞数量分别显著增加和减少。经统计学分析RGD-FasL的凋亡指数等同于或大于FasL的凋亡指数。7、Western blot分析显示,RGD-FasL和FasL处理腺瘤细胞后,Caspase-8、Caspase-9、Caspase-3、RANKL和JNK2的表达明显增加,而Bcl-2的表达明显减少。在GH3细胞中RANKL和JNK2的表达较低。Caspase抑制实验证实了RGD-FasL正是通过Caspase途径诱导了垂体腺瘤细胞的凋亡。结论我们首次人工构建的FasL和RGD-FasL通过Caspase途径诱导了垂体腺瘤细胞的凋亡和细胞周期的停滞,从而发挥其抑制垂体腺瘤细胞生长的作用。RGD-FasL对垂体腺瘤细胞的生长抑制效应等同于FasL,由于RGD本身具有肿瘤病理血管的靶向性功能,因此RGD-FasL较之FasL在垂体腺瘤的生物治疗方面更具特异性、安全性和临床应用价值。