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萝卜(Raphanus sativus L.)是一种重要十字花科蔬菜作物,具有较高的食用和药用价值。硫代葡萄糖苷(简称硫苷)中的4-甲基亚磺酰丁基硫苷(Glucoraphanin, RAA)的水解产物萝卜硫素(Sulforaphane,SF)是到目前为止在蔬菜中发现的抗癌效果最强的活性物质之一。硫苷是十字花科蔬菜中的一类重要次生代谢产物,硫苷及其降解产物具有抗虫、影响风味和抗癌等作用。近年来随着对拟南芥和白菜基因组全序列测定的完成,人们对硫苷的生物合成代谢途径及相关重要基因有了较为深入的了解,但是目前未见在萝卜中有关硫苷合成调控基因的报道。本论文克隆了脂肪族硫苷合成代谢过程中相关重要基因序列及其启动子序列,并对其中部分基因在萝卜中的表达特性进行了初步研究,以期通过基因改良工程或表达调控手段选育高硫苷含量的萝卜新品种奠定理论基础。本研究的主要结果如下1.利用电子克隆法从十字花科蔬菜萝卜中分离获得硫苷合成代谢过程中RsBCAT4、RsUGT74B1、RsGS-OX1的3个关键基因序列。将得到基因的开放阅读框序列及推导的氨基酸序列与GenBank中已公布相应序列进行同源性比较构建系统进化树。另外利用半定量及荧光定量PCR技术研究其在不同发育时期(不同部位)的表达情况；此外,利用荧光定量PCR技术对不同处理(伤害,MeJA)下的萝卜叶片进行表达分析。结果表明RsBCAT4在幼苗期(叶、茎、根)均表达,在膨大期和成熟期根部基本不表达,RsUGT74B1在幼苗期、在膨大期和成熟期表达量均很低RsGS-OX1在正常情况下表达量很低,但这三个基因在WO、MeJA处理后表达量均明显增大。2.利用电子克隆法分离获得RsCYP79F、RsCYP83A1、RsSUR1和RsSOT18基因的cDNA及DNA序列；同时应用染色体步移法分离获得这四个基因的启动子序列。用PLACE、PlantCARE在线预测工具分析表明：其序列含有启动子特定调控元件(如TATA-box, CAAT-box等),还有一些顺式调控元件(如MYB结合位点、ABA响应元件、GA响应元件、MeJA响应元件、光响应元件等)和一些其它调控元件,这说明这四个基因的表达可能受这些因素的调控。3.利用电子克隆法分离获得RsMyr1和RsMyr2基因cDNA及DNA序列；同时利用染色体步移法分离获得RsMyr2基因启动子序列。用PLACE、PlantCARE在线预测工具分析表明：其序列含有启动子的特定调控元件,(如CAAT-box,TATA-box等),还有一些顺式调控元件(如MYB结合位点、ABA响应元件、GA响应元件、茉莉酸响应元件、光响应元件)和一些其它的调控元件,说明萝卜RsMyr2基因的表达可能受这些因素调控；另外将RsMyrl和RsMyr2基因成熟编码区(去除信号肽)连接到表达载体pET-30α,转化大肠杆菌BL21(DE3)后诱导重组蛋白的表达。经IPTG诱导后进行SDS-PAGE电泳,产生了比预期大约8%的重组蛋白。最后构建了RsMyr2的过表达载体。研究结果为评价萝卜黑芥子酶分子特征和生物学功能提供了理论基础。