背景与目的：　　雌激素（estrogen，E2）是乳腺癌的主要致癌原，通过与雌激素受体（estrogen receptor，ER）结合而促进肿瘤细胞的增殖和生长。在绝经后的乳腺癌患者中，雌激素的主要来源是外周组织中的雄激素通过芳香化酶（aromatase，Arom）的催化作用转化为雌激素，芳香化酶抑制剂（aromatase inhibitors, AIs）可阻断这一反应，从而阻断肿瘤细胞的生长,是绝经后激素受体阳性的乳腺癌患者辅助内分泌治疗的一线方案。　　然而，AIs的耐药成为临床应用中的最大问题，过去的研究主要集中在ER，ER信号通路与生长因子受体信号通路之间的串话机制研究，目前AIs的耐药机制仍不明确。芳香化酶（aromatase, Arom）是利用睾酮合成雌激素的限速酶，广泛存在于人体，在女性胎盘，脂肪组织及脑（包括下丘脑，海马，杏仁核等）中含量较高。雄激素经芳香化酶、NADPH等辅基的氧化还原反应转化为雌激素的同时还可产生活性氧（reactive oxygen species, ROS）。在正常的生理情况下，机体多种抗氧化酶SOD、GPx、GST、CAT等不断清除细胞内产生的ROS及自由基。ROS在不断产生及清除中保持氧化还原系统稳定，并在人体整个生理过程中发挥重要作用。ROS在肿瘤中也有重要作用，是参与细胞内信号传导的第二信使。已有研究表明ROS、E2可以激活c-src激酶及下游信号通路，Arom可以被c-src激酶磷酸化，磷酸化位点是第361位的酪氨酸（pY361Arom）。我们的前期研究表明Y361-Arom可以与PI3K调节亚基p-85结合，激活PI3K信号通路，而c-src激酶的抑制剂AZD0530（PP2）可以阻断这种结合，逆转乳腺癌细胞对AIs的耐药。因此我们推测：1、Arom在乳腺癌中维持体内氧化还原系统稳定中发挥重要作用，对乳腺癌的发生及发展具有重要影响。2、c-src可被ROS、AD激活，继而引起芳香化酶的磷酸化，激活下游PI3K信号通路，可能是导致AIs发生耐药的主要原因之一，pY361Arom可能是预测乳腺癌对AIs敏感性的一个标志物。本研究制备了特异识别Y361磷酸化芳香化酶的抗体，将对Arom及pY361Arom在乳腺癌发生发展中的作用及AIs耐药的机制进行探索性研究。　　方法：　　第一部分 pY361Arom抗体制备及在乳腺癌中的临床意义　　1.公司合成多肽片段，通过动物免疫的方法制备了pY361Arom多克隆抗体，用ELISA、免疫印迹、免疫组化等方法鉴定其敏感性和特异性；　　2.收集汕头大学医学院附属肿瘤医院用AIs内分泌治疗的绝经后乳腺癌患者60名，通过回顾性分析其临床资料，归纳总结临床病理资料，采用免疫组化的方法检测乳腺癌组织中pY361Arom的表达情况，并用SPSS17.0软件进行统计学分析，采用卡方检验及Fisher精确检验来分析 pY361表达水平与乳腺癌患者临床病理学参数的关系；采用 Kaplan-Meier生存分析方法进行总生存分析，组间比较采用log-rank检验法。P≤0.05为差异具有统计学意义。　　第二部分 Arom在ER阴性的乳腺癌细胞株中的作用　　1.建立稳定敲减Arom的SKBR3-shArom细胞系，采用细胞增殖实验，划痕实验，克隆形成实验，迁移及侵袭实验，用免疫印迹法检测Arom对pAKT(S473), p-85等蛋白的影响来探讨Arom对ER阴性的乳腺癌细胞的作用；　　2.c-Src抑制剂（PP2）处理BT549, SKBR3, MDA-MB-231细胞后，用免疫印迹的方法探讨PP2对pAKT(S473), pSrc(Y416), pY361Arom, p-85等蛋白的影响。　　第三部分 Arom在ER阳性的乳腺癌细胞株中的作用　　1.采用高表达 ER的BT549-ER细胞株，在无外源性雌激素培养的状态下用分别用雌二醇（Estradoil, E2）和雄烯二酮（androstendine, AD）, Letrozole, PP2处理细胞，观察细胞增殖情况，用免疫印迹法探讨其对Src(Y416), pAKT(S473), p-85, pY361Aro蛋白的影响；　　2.雄烯二酮（androstendine, AD）, Letrozole, PP2处理细胞，用免疫印迹探讨其对pSrc(Y416), pAKT(S473), p-85, pY361Arom等蛋白的影响；　　3.BT549-ER, SKBR3细胞株，在无外源性雌激素培养的状态下，用DCFH-DA法检测细胞活性自由氧（reactive oxgene species, ROS）水平的方法探讨AD，Letrozole对细胞内ROS的影响。　　结果：　　第一部分　　1.制备了pY361Arom多克隆抗体，效价约1:1万，该抗体可用于ELISA, WB, IHC, IF。WB可特异性的检测到蛋白pY361Arom，大小约55KD，最佳浓度1:1000，IHC最佳浓度1:2500，IF最佳浓度1:400,均为4℃过夜；　　2.pY361Arom主要定位在乳腺癌细胞浆内，Kaplan-Meier生存分析显示pY361Arom高表达与患者总生存期显著相关，p≤0.05。但pY361Arom的表达与患者年龄、组织学分级、分期、ER、PR、Her2表达无相关性。　　第二部分　　1.敲减Arom后SKBR3细胞增殖减弱，与对照组相比p=0.042，具有统计学差异，迁移能力从95％±4.5%下降到36%±4.6%，侵袭能力从94%±4.3%下降到42%±4.2%和克隆形成能力从60%±4.5%下降到38%±4.3%，经统计检验，p≤0.05具有统计学差异，敲减Arom后, pAKT（S473）蛋白表达降低，p-85蛋白表达不变；　　2.PP2处理BT549，MDA-MB-231, SKBR3细胞后pSrc(Y416)，pY361Arom，pAKT（S473）蛋白表达降低；　　3.SKBR3细胞免疫荧光Arom与p-85，pY361Arom与p-85在细胞浆共定位。　　第三部分　　1.AD，E2促进BT549-ER细胞增殖能力，AD最佳浓度为100nM，与对照组相比p=0.04，E2最佳浓度为1nM,与对照组相比p=0.03，PP2，Letrozole处理BT549-ER细胞后,细胞增殖能力降低，与对照组相比p≤0.05具有统计学差异；　　2. AD浓度100nM处理BT549-ER后细胞后，pSrc(Y416)，pY361Arom，pAKT（S473）蛋白表达明显升高。PP210μM，Letrozole100nM处理BT549-ER细胞后免疫印迹pSrc（Y416），pY361Arom，pAKT（S473）蛋白表达降低；　　3.DCFH-DA法检测BT549细胞过表达ER前后加用100nM浓度AD处理2小时后，细胞内ROS水平明显上升分别上升约45%±4.2%和47%±3.6%，p≤0.05具有统计学意义，Let处理2小时后两株细胞内ROS水平均无明显变化。SKBR3经AD处理后ROS水平升高约48%±3.2%，与未作任何处理的对照组相比具有统计学意义，p≤0.05，而经Let处理后ROS水平无明显变化；在敲减了Arom的细胞SKBR3-shArom中，经AD和Let处理后细胞内ROS水平无明显变化。　　结论：　　1.制备了pY361Arom兔多克隆抗体。　　2.Arom敲减后可抑制SKBR3细胞的增殖、迁移、侵袭、克隆形成，可能机制是下调pAKT（S473），同时对细胞内氧化还原稳定有重要调控作用，影响着乳腺细胞的发生和发展。　　3.Src抑制剂PP2对BT549，MDA-MB-231细胞敏感，而对SKBR3细胞不敏感。　　4.AD, E2可刺激BT549-ER细胞的增殖，PP2，Letrozole可抑制其细胞的增殖。　　5.pY361Arom可能是一个预测AIs耐药的分子标志，其机制可能是AD通过芳香化酶及NADPH的氧化还原反应生成E2同时产生ROS，ROS及AD本身激活Src，引起pY361Arom活化，激活PI3K/AKT/mTOR，引起肿瘤细胞增殖。